克隆抗體和抗體工程-資料下載頁
2024-09-20 20:38本頁面
【正文】 Vk(1/76) Jk(1/5) Ck B 基因重排后得到的輕鏈 ES細胞 人重鏈基因 YAC 人輕鏈基因 YAC H κ 抗體基因敲除的小鼠 抗體基因敲除的小鼠 hH hκ 只表達人重鏈的純合轉基因鼠 只表達人輕鏈的純合轉基因鼠 hAb 只表達人源抗體的純合轉基因鼠 第四節(jié) 基因工程抗體和抗體工程 一、噬菌體抗體庫技術的基本方法 獲得目的基因 抗體庫技術的載體：現(xiàn)在普遍使用噬菌粒（ phagemid） 載體，其中的 pHEN1為新一代載體，轉化效率高，有利于提高庫容量。 淘篩：抗原固定化后，對噬菌粒群的吸附、洗滌和洗脫后再感染擴增，與輔助噬菌體超感染獲得大容量次級文庫，再反復與抗原吸附，經(jīng)幾輪淘篩后，淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量擴增。 四、表達與鑒定：目的克隆經(jīng)過鑒定后，再導入感受態(tài)菌株，進行可溶性表達，其產(chǎn)物用 western blot分析確定后，就完成了全過程。 二、噬菌體抗體庫技術的特點 模擬天然全套抗體庫 ?抗體文庫 ?1011庫容，能包含 B細胞全部克隆。 ?建庫的外源基因來自人外周血、骨髓或脾臟的淋巴細胞提取的 mRNA反轉錄形成的cDNA擴增，使用的通用引物采自多個人體，具有人的種屬普遍性。 ?VH和 VL隨機重組增加抗體的多樣性。 避開了人工免疫和雜交瘤技術 可獲得高親和力的人源化抗體 ?在噬菌體抗體庫中， VH和 VL基因的隨機重組模擬了體內(nèi)抗體親和力成熟過程，所用抗體基因又都是來自人體， ?因此產(chǎn)生的抗體必然都是高親和力的。 三、基因工程抗體的表達 原核細胞表達 真核細胞表達 轉基因植物表達 轉基因動物表達 第五節(jié) 抗體診斷試劑 一、血清學鑒定用的抗體類試劑 鑒定病原菌的抗體試劑：診斷血清制備步驟： （ 1）制備細菌抗原， O（ 菌體）抗原， H（鞭毛）抗原； （ 2）免疫動物和制備抗體血清 乙型肝炎病毒表面抗原（ HBsAg） 的反向被動血凝診斷試劑 妊娠診斷試劑 抗 ABO血型系統(tǒng)血清 二、免疫標記技術用的抗體類試劑 熒光抗體診斷試劑 ?熒光色素如異硫氰酸熒光素（ FITC） 等標記抗體球蛋白，即成為熒光抗體。 ?用熒光抗體浸染含有抗原物質的組織切片或細胞，熒光抗體與抗原集合，在熒光顯微鏡下成為可發(fā)光的可視物，從而達到診斷或定位的目的。 （ 1）熒光抗體的制備 （ 2）免疫熒光測定法有直接和間接兩種方法。 免疫酶抗體診斷試劑 免疫酶技術是用酶標記抗體來檢測抗原的方法，本法分為免疫酶染色（組化法）和酶免疫測定（ EIA） 兩種類型。 （ 1）免疫酶染色法用抗體診斷試劑：常用的酶為HRP， 其底物為二氨基聯(lián)苯胺（ DAB）， 兩者作用可生成棕褐色沉淀物質，使抗原呈色。 （ 2）酶免疫測定用抗體診斷試劑：見書中介紹的幾種試劑，重點掌握酶免疫法的基本概念。比如 ELISA方法（夾心法、間接法）。 放射免疫用抗體診斷試劑 抗體的表達系統(tǒng) ? 哺乳動物細胞 :具有對蛋白進行正確表達的加工翻譯后修飾的能力 ,能抗體分泌出來。但不能表達完整有功能的抗體。 ? 細菌 :抗體片段 ,不能完整地表達抗菌素體 , 抗體分子遇到不能糖基化、組裝錯誤以及不能形成正確的二硫鍵；容易形成包函體 ? 抗體片段分子前加上 前導序列 ，可以表達并分泌到胞外。 組合抗體文庫 ?常用的表達系統(tǒng) :絲狀噬菌體 ,主要包括大腸桿菌絲狀噬菌體、 M1 fd、 f1。 ? 結構特性： ◎ 單鏈環(huán)狀 DNA分子 。 ◎ 5 種外殼蛋白（ Ⅷ 、 Ⅲ 、 Ⅵ 、 Ⅶ 和 Ⅸ ）； ◎蛋白 Ⅷ ,位于絲狀噬菌體的管狀部分 ◎ Ⅲ ,Ⅵ 和 Ⅶ ,Ⅸ 分別位于兩端 。 ◎ 外源基因與外殼蛋白的 Ⅲ 基因連接 。 在絲狀噬菌體中表達抗體的過程 絲狀噬菌體抗體文庫的構建 組合抗體文庫的優(yōu)點 ? 省去了單元克隆抗體制備過程中許多費時費力的過程，改變了制備單隆抗體的思路； ? 使單克隆抗體的制備由細胞水平進入到基因水平，為解決人源單抗體的制備提供了新的途徑； ? 重、輕鏈的隨機組合提高了抗體的多樣性。 解決分離抗體親和力較低的抗體的方法： ? 噬菌體展示技術（ phage display）：將 Fv和 Fab片段以多拷貝抗體的形式表達在絲狀噬菌體的表面上，這就是～。 使用人源可變區(qū)制造完全人的基因編碼的抗體方法： ? 基本原理：絲狀體的外殼蛋白 Ⅲ 基因和外源抗體之間引入一個琥珀突變密碼子 UAG。 ? 當絲狀體感染有琥珀突變抑制的大腸桿菌株時， UAG密碼子被讀為 Glu，外源蛋白就可以整合蛋白的形式附著于噬菌體表面； ? 則 UAG被讀為終止密碼子，外源蛋白就以可溶性蛋白的形式被分泌到細菌體外。
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