【正文】 續(xù)化和自動化 。 固定化酶方法 ： 載體結(jié)合法、交聯(lián)法、包埋法 ：將酶結(jié)合于水不溶性載體的一種固定化方法。根據(jù)結(jié)合的形式不同，又可分為 物理吸附法、離子結(jié)合法和共價結(jié)合法 等。 ：指酶被物理吸附于不溶性載體的一種固定化方法。載體有活性炭、多孔玻璃、氧化鋁、硅膠、淀粉、合成樹脂等。 特點： 酶活性中心不易被破壞 ， 酶結(jié)構(gòu)變化少的優(yōu)點 ，但它有酶與載體相互作用力弱 ， 酶易脫落的缺點 。 ： ? ：酶通過離子鍵結(jié)合于具有離子交換基的水不溶性載體的固定化方法 。 此法的載體有多糖類離子交換劑和合成高分子離子交換樹脂 。 例如 DEAE— 纖維素 、 GM— 纖維素等 ? 特點 ：操作簡單 ， 條件溫和 ， 酶的高級結(jié)構(gòu)和活性中心的氨基酸殘基不易被破壞 ， 能得到酶活回收率較高的固定化酶 。 但是載體與酶的結(jié)合力較弱 ， 容易受緩沖液種類或 pH的影響 ， 在離子強(qiáng)度高的條件下反應(yīng)時 ， 酶易從載體上脫落 。 ： ? C共價結(jié)合法 ： 酶以共價結(jié)合于載體的固定化方法 ， 它是載體結(jié)合法中應(yīng)用最多的一種 。 此法或是將載體有關(guān)基團(tuán)活化 ， 然后與酶有關(guān)基團(tuán)發(fā)生偶聯(lián)反應(yīng)；或是在載體上接一個雙功能試劑 ， 然后將酶偶聯(lián)上去 。 可與載體結(jié)合的酶的功能團(tuán)有氨基 、 羧基 、 羥基 、 酚基等 。 ? 特點： 共價結(jié)合法反應(yīng)條件比較苛刻 ， 操作復(fù)雜 ， 并且易引起酶高級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生變化 ， 破壞了部分活性中心 ， 酶活回收率一般為 30％ 左右 。代表性的方法有重氮法 、 溴化氰法等 。 ? 雙功能或多功能試劑 使酶與酶之間交聯(lián)的固定化方法。 ? 此法與共價結(jié)合法一樣也是利用共價鍵固定酶的， 不同的是它不使用載體 。做為交聯(lián)劑的有形成希夫堿的戊二醛、形成肽鍵的異氰酸酯、發(fā)生重氮偶合反應(yīng)的雙重氮聯(lián)苯胺等。 ? 特點： 應(yīng)用條件較激烈、酶活回收率低。 分網(wǎng)格型和微囊型 ? 網(wǎng)格型：埋在高分子凝膠細(xì)微網(wǎng)格中的方法 。 ? 微囊型：包埋在高分子半透膜中的方法 。 ? 特點：包埋法一般很少改變酶的高級結(jié)構(gòu) ， 酶活回收率較高 ， 因此可用于許多酶的固定化 ，但必須巧妙地設(shè)計反應(yīng)條件 。 ? 適合范圍 ：小 分子底物和產(chǎn)物的酶 ， 因為只有小分子才可以通過高分子凝膠的網(wǎng)格進(jìn)行擴(kuò)散 。 固定化酶的模式 (5)疏水作用； （ 6）脂質(zhì)體包埋； （ 7）微膠囊 固定化酶催化的動力學(xué)特征 ? 酶固定化后性質(zhì)的變化 ? 評價固定化酶指標(biāo)：酶活力表現(xiàn)率和酶活力收率 ? 影響固定化酶動力學(xué)的因素 ? 固定化酶反應(yīng)動力學(xué) 固定化酶催化的動力學(xué)特征 ? 酶固定化后性質(zhì)的變化 ： ① 底物專一性的改變： ② pH的改變 ③ 穩(wěn)定性 —— 熱的穩(wěn)定性 、 貯藏穩(wěn)定性 、 操作穩(wěn)定性 ④ 動力學(xué)的改變 。 ? 原因： ① 酶自身的變化 —— 主要由于活性中心氨基酸殘基 、 空間結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)變化； ② 載體的物理和化學(xué)性質(zhì)的變化 。 大多數(shù)酶在固定化后，其 Km值增加，表示 催化反應(yīng)活性將下降。也有少數(shù)酶固定化后活性無變化，甚至有所增大。 評價這種活性變化可用下述兩種指標(biāo)來衡量：酶活力表現(xiàn)率和酶活力收率。 ? 酶活力表現(xiàn)率 （ 相對活力 ） ： 實際測定的固定化酶的總活力與被固定化了的酶在溶液狀態(tài)時的總活力之比 。 ? 酶活力收率 （活力回收）： 實際測定的固定化酶的總活力與固定化時所用的全部游離酶的活力之比。 上述兩種指標(biāo)之差別在于是否考慮了所剩余的未被固定化的酶。 影響固定化酶動力學(xué)的因素 ? 分子構(gòu)象的改變 ? 位阻效應(yīng) ? 微擾效應(yīng) ? 分配效應(yīng) ? 擴(kuò)散效應(yīng) 固定化酶反應(yīng)歷程 ① 底物從液相主體傳向固定化酶周圍的滯流液層（外表面）； ②底物擴(kuò)散通過這一滯流液層到載體外表面； ③進(jìn)行酶促反應(yīng)； ④底物由載體外表面向載體內(nèi)擴(kuò)散； ⑤產(chǎn)物由內(nèi)部擴(kuò)散到載體外表面； ⑥產(chǎn)物由載體外表面到滯流液層； ⑦產(chǎn)物由滯流液層傳遞到主體溶液 ? 當(dāng)酶固定化于載體的外表面時，沒有④ 和⑤兩個階段。 ? ①和② 、⑥和⑦是屬于外擴(kuò)散過程， ④、 ⑤則為內(nèi)擴(kuò) 散過程。 ? 可以看出，固定化酶的催化反應(yīng)受到了物質(zhì)傳遞和酶促反應(yīng)兩個方面的影響。 固定化酶反應(yīng)歷程 影響固定化酶動力學(xué)的因素 （ 1）分子構(gòu)象的改變 ：指固定化過程中酶和載體的相互作用引起酶的活性中心或調(diào)節(jié)中心的構(gòu)象發(fā)生了變化，導(dǎo)致酶與底物的結(jié)合活力下降的一種效應(yīng)。 ? 特點：難以定量描述與預(yù)測。 多出現(xiàn)于吸附法和共價偶聯(lián)法的固定化酶中 。 （ 2）位阻效應(yīng) ： 載體的遮蔽作用 (如載體的空隙太小，或者固定化位置或方法不當(dāng)，給酶的活性中心或調(diào)節(jié)中心造成空間障礙，使底物和效應(yīng)物無法與酶接觸等 )引起的。 ? 特點： 選擇適宜的載體與固定化方法，可消除這種不利因素的影響，但這種效應(yīng)難以定量描述 與預(yù)測。 （ 3）微擾效應(yīng) ? 由于載體的親水性、疏水性及介質(zhì)的介電常數(shù)等，使緊鄰固定化酶的環(huán)境區(qū)域 (微環(huán)境 )發(fā)生變化，改變了酶的催化能力及酶對效應(yīng)物做出調(diào)節(jié)反應(yīng)的能力。 ? 特點：這種效應(yīng)難以定量描述和預(yù)見 ， 但可以通過改變載體與介質(zhì)的性質(zhì)而做出判斷與調(diào)節(jié) 。 空間效應(yīng)模擬圖 （ 4）分配效應(yīng) ? 分配效應(yīng)是由于固定化載體與底物或效應(yīng)物之間的疏水性，親水性及靜電作用所引起微環(huán)境 (固定化酶緊鄰的微觀局部環(huán)境 )和宏觀環(huán)境之間物質(zhì)的不等分配，改變了酶反應(yīng)系統(tǒng)的組成平衡，從而影響酶反應(yīng)速率的一種效應(yīng)。 ? 特點：可以通過分配速率 KP來定量描述 （ 4）分配效應(yīng) Kp的定義是載體內(nèi)外底物 (或其他物質(zhì) )濃度之比 。 ? 測定 Kp方法：在已知濃度和體積的底物溶液中 ， 放人不含底物的一定體積的載體 ， 并保持適宜條件 ， 當(dāng)達(dá)到平衡時 ， 測定載體外溶液中的底物濃度 。 （ 5）擴(kuò)散限制 ? 指底物、產(chǎn)物及其他效應(yīng)物的遷移和傳遞速度所受到的一種限制。 ? 物質(zhì)的傳遞過程包括分子擴(kuò)散和對流擴(kuò)散。這種擴(kuò)散過程的速率在某些情況下可能會對反應(yīng)速率產(chǎn)生限制作用。 ? 擴(kuò)散限制效應(yīng)可分為外擴(kuò)散限制效應(yīng)和內(nèi)擴(kuò)散限制效應(yīng)。 ? 特點：可以通過引入相應(yīng)的參數(shù)進(jìn)行定量分析。 分配效應(yīng)與擴(kuò)散效應(yīng) 分配效應(yīng) 擴(kuò)散效應(yīng) 分配和擴(kuò)散效應(yīng)同時作用 固定化酶剖面圖及濃度分布圖 固定化酶反應(yīng)動力學(xué) ? 本征動力學(xué) 指酶的真實動力學(xué)行為 ， 包括溶液酶和固定化酶在內(nèi) 。 對后者 ， 它僅將空間效應(yīng)的影響考慮在內(nèi) 。 從這個意義上講 ， 固定化酶的本征動力學(xué)與溶液酶的本征動力學(xué)是有差別的 。 ? 固有動力學(xué) 在本征動力學(xué)的基礎(chǔ)上，僅僅考慮由于這種分配效應(yīng)而造成的濃度差異對動力學(xué)產(chǎn)生的影響，所建立的動力學(xué)稱為固有動力學(xué) ? 表觀動力學(xué) 表觀動力學(xué) ? 不論分配效應(yīng)是否存在，固定化酶受到擴(kuò)散限制時所觀察到的速率稱為有效反應(yīng)速率，或稱為宏觀反應(yīng)速率。 ? 據(jù)此所建立的動力學(xué)方程稱為宏觀動力學(xué)方程 ， 或稱為有效動力學(xué)方程 。 ? 所建立的宏觀動力學(xué)方程也不完全服從M— M方程形式 。 固定化酶反應(yīng)動力學(xué) 外擴(kuò)散限制效應(yīng) ? 特征： ① 底物：液相主體 固定化酶外表面 固定化酶外表面反應(yīng) ② 產(chǎn)物：固定化酶外表面 液相主體 ? 外擴(kuò)散是先于反應(yīng)發(fā)生，與反應(yīng)過程是串聯(lián)進(jìn)行的。 ? 假定對一非帶電的固定化酶 ， 其外表面上的反應(yīng)速率符合 M— M方程形式 ， 即 底物由液相主體擴(kuò)散到固定化酶外表面的速率應(yīng)表示為 NS=kLα([S][S]S) kLα—— 體積氧傳遞系數(shù) （ 1/S） ? 定態(tài)條件下 ， 應(yīng)存在 Rs＝ Ns， 即該式表示了在定態(tài)條件下 ， 外擴(kuò)散傳質(zhì)速率等于在固定化酶外表面上底物的反應(yīng)速率 。 SmSm a xS]S[K]S[rR??B分析： ① 若 Rs＜＜ Ns ， 即外表面反應(yīng)是控速步驟 ， 則 最大反應(yīng)速率； ② 若 Rs＞＞ Ns ， 即外擴(kuò)散是控速步驟 ， 則 r= Ns= kLα [S]= N0 0s0m0m a xS R]S[K]S[rRr ????C求解 —— 圖解 ① [S]0較低 ， RS0＞ N0， 外擴(kuò)散是控速步驟； ② [S]0較高 ， RS0＜ N0， 外 表 面 反 應(yīng) 是 控 速 步驟； ③ [S]0處于中間； RS0、N0相差不大 ， 則有 RS = N0 通過 Dα計算求解 。 RS=NS， C*=[S] S/[S], K=Km/[S] 1 C*= Da C*/（ K + C* ） α ＜ 0 α ＞ 0 + α = Da +K1， [S] S= C* [S] SmSm a xS]S[K]S[rR??NS=kLα（ [S][S]S） [ S ]m a xakrDL?????????????? 1412 2**?? KC Dα—— 重要無因次數(shù)群 ? 定義 ： ? 物理意義可表示為 ： 1. 當(dāng) Da ＜＜ 1時，酶催化最大反應(yīng)速率要大大慢于底物的擴(kuò)散速率。此時該反應(yīng)過程為反應(yīng)動力學(xué)控制。接近本征動力學(xué)； Da ＞＞ 1時，則底物最大擴(kuò)散速率要大大慢于酶催化底物的反應(yīng)速率，此時該反應(yīng)過程為傳質(zhì)擴(kuò)散控控制。接近擴(kuò)散動力學(xué)。 ? 應(yīng)用： ，即 Da ＜＜ 1 ① 降低固定化酶顆粒的粒徑，增大比表面積，但由于粒徑減小會伴隨壓降增加，因此應(yīng)用中綜合考慮，確定合適的粒徑。 ②使固定化酶表面流體處于湍流狀態(tài)以增大 。 2. 圖解 最大傳質(zhì)速率最大反應(yīng)速率??D[ S ]m a xakrDL?? 2. 圖解 ? 底物在固定化酶外表面處的濃度應(yīng)同時滿足傳質(zhì)速率方程式和反應(yīng)速率方程式，因此可通過作圖法求出 [S]值和相應(yīng)的速率值。 例：某酶固定于無微孔的球形載體上，在排除外擴(kuò)散影響的條件下測得其動力學(xué)參數(shù)為rmax=4 105mol/(L s)， Km=2 105mol/L，現(xiàn)將固定化酶顆粒裝入底物濃度為 1 105mol/L的反應(yīng)器中，并已知在這一操作條件下的流體傳質(zhì)系數(shù)為 4 101(1/S)，求：底物在固定化酶的外表面的反應(yīng)速率。 10101104 104 5150m ax ??????????SLa CkrDa2101102][ 550* ???????SKK m 解： 1112101* ??????? KDa?111241211141222**?????????????????????????? KC[S] S= C* [S]= 1 105 = 106 mol/L 反應(yīng)速率 s)m o l / ( ][][56565m ax?????????????????SmSSSKSrR（外擴(kuò)散） 0o u trro u t ??? 率化酶外表面處的反應(yīng)速無外擴(kuò)散影響時的固定反應(yīng)速率有外擴(kuò)散影響時的實際m a xo u t0o u to u t rrr ????)()1(][**m ax][m a x??? DcKKcrSK SmSr So u t?????? ： 內(nèi)擴(kuò)散于反應(yīng)同時發(fā)生 ， 與反應(yīng)過程是并