【正文】 e n z o t h i o p h e n e2 39。 Hy d ro x y b i p h e n y l 2 s u l f i n a t e (HB P S i )2 Hy d ro x y b i p h e n y l ( 2 H B P )N A DD s z A : D B T d i o x i d e m o n o o x y g e n a s eD s z B : H B P S i d e s u l f i n a s eD s z C : D B T m o n o o x y g e n a s eD s z D : F l a v i n re d u c t a s e+(DB T )D i b e n z o t h i o p h e n e 5 o x i d e (DB T O )D i b e n z o t h i o p h e n e 5 , 5 d i o x i d e (DB T O2)+ S O32+ S O4or22 M e t h o x y b i p h e n y l (2 M B P )OMT b. 針對 Benzothiophene，作為模式化合物，進行了降解分析，表明菌株可以利用BTH為唯一硫源生長并脫除其中的硫生成了 O羥基苯乙烯 (圖 )。 菌株 X7B代謝 BTH的 GC/MS分析 菌株 X7B代謝 BTH的 GC/MS分析 菌株 X7B代謝 BTH的 GC/MS分析 菌株 X7B代謝 BTH的途徑 SSOSO OOSO OSOOO HOO HOABCDEFGHohydroxystyrene 菌株脫硫研究進展 c. 以 Thiophene carboxylic acid為模式化合物 ， 進行了菌株代謝 THC的 途徑分析 。 菌株代謝 THC分析 5 10 15 20 25 30M i n u t e s2 . 55 . 07 . 51 0 . 01 2 . 51 5 . 01 7 . 5m V o l t sc : \ s t a r \ d a t a \ l i f u l i \ r e s u l t s \ 2 0 0 3 1 1 t h c \ t h c i n e a 2 0 0 3 1 1 6 . r u n5101520m V o l t sc : \ s t a r \ d a t a \ l i f u l i \ r e s u l t s \ 2 0 0 3 1 1 t h c \ t h c i n m e o h 2 0 0 3 1 1 6 . r u n123456m V o l t sc : \ s t a r \ d a t a \ l i f u l i \ r e s u l t s \ 2 0 0 3 1 0 t h c \ . r u n推測的THC代謝途徑 SC H2SC H2OSC H2OOC H2O HT C A親水性集團親水性集團親水性集團親水性集團③ 菌株脫硫基因克隆 a. 根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的紅平紅球菌 IGTS8的脫硫基因序列，設(shè)計引物，進行 PCR擴增獲得了脫硫基因。 b. 將脫硫基因連接到 T載體上，在大腸桿菌宿主進行表達，結(jié)果表明菌株可以利用 DBT為唯一硫源進行生長，并能夠脫除其中的硫生成 2HBP。同時表明不和X7B菌株一樣，沒有生成 2MBP。證明甲基化的性狀是和另外的酶相關(guān)。 菌株脫硫基因克隆 c. 根據(jù)脫硫基因測序結(jié)果，在 NCBI檢索 DszC酶的同原性序列并進行了分析，結(jié)果 如圖 。Arensforf等（ 2022， 68(2):691698, Appl. Environ. Microbiol.）報道，通過定向進化技術(shù)，篩選獲得一株菌株，可以作用于 5M－ BT，基因測序結(jié)果表明，因為一個堿基由 G變成 T，導致 DszC的 261位氨基酸突變（ V261F ）。 DszC酶的系統(tǒng)進化樹 B a c i l l u s s u b t i l i s ( 0 . 0 3 0 8 )M y c o b a c t e r i u m s p . G 3 ( 0 . 0 3 9 0 )P a e n i b a c i l l u s s p . A 1 1 2 ( 0 . 3 5 3 3 )G o r d o n i a s p . C Y S K 2 ( 0 . 0 4 4 6 )M y c o b a c t e r i u m s p . X 7 B ( 0 . 0 1 0 4 )R. e r y t h r o p o l i s I G T S 8 ( 0 . 0 0 1 0 )R. e r y t h r o p o l i s L S S E S 8 1 ( 0 . 0 0 8 6 )d. 下一步，計劃分別克隆表達 DszA， B，C酶。準備使用 pET表達型載體，并使用鎳柱進行親和純化。 ④ 高密度培養(yǎng)脫硫催化劑進行燃油生物脫硫試驗 ? 高密度培養(yǎng)脫硫催化劑 ? 進行柴油脫硫試驗 ? 進行汽油脫硫試驗 ?(I)高密度生長和酶誘導二步式工藝 ：即解除培養(yǎng)中的硫源限制，先用廉價的無機硫酸鹽代替有機硫，采用 pH、 碳源等最優(yōu)控制技術(shù)，使菌體生長產(chǎn)量達到最大 (高密度菌體生長 )，再用少量的有機硫誘導菌體以制備酶源。 ?(II)高密度生長和酶誘導一步式工藝 ：用少量的有機硫作為酶系產(chǎn)生的誘導物，用無機硫作為非限制性硫源高密度生產(chǎn)菌體和過量生產(chǎn)該脫硫催化劑。 Biostat B2 pO2 (%) time(h) Biostat UD50 MFCS Control bfxhgf xc hg f 生物脫有機硫催化劑優(yōu)化生產(chǎn) 高濃度脫硫細胞培養(yǎng)優(yōu)化 不同碳源對菌株生長的影響 02468101214161820葡萄糖 甘油 醋酸 檸檬酸鈉菌體濃度(620nm) 高濃度脫硫細胞培養(yǎng)優(yōu)化 不同的濃度甘油對生長的影響 00 1 2 3 4甘油濃度(%)比生長速率(h1) 高濃度脫硫細胞培養(yǎng)優(yōu)化 不同的氮源濃度對生長的影響 0 . 0 0 . 5 1 . 0 1 . 5 2 . 002468101214菌體濃度(620nm)氯化銨 (%) 高濃度脫硫細胞培養(yǎng)優(yōu)化 pH值恒定流加碳源菌體生長及在 線檢測參數(shù)曲線 10 20 30 40 50 60 700246810121416菌體濃度X(mg/ml)時間 /h10 20 30 40 50 60 70200300400500600PH攪拌轉(zhuǎn)速(rpm)時間 /h020406080100溶氧飽和度溫度r p m溶解氧飽和度(%) 0102030405060溫度 0246810 PH 處理柴油（ 535 ppm）含硫化合物檢測 X7B休止細胞作用于柴油后， GCAED檢測含硫化合物變化。 535 ppm 72 ppm 柴油（ 535 ppm ）中烷烴變化情況 GCFID檢測柴油經(jīng)過生物催化劑處理前后烷烴變化， 圖中顯示烷烴為 C12C25。 BDS汽油脫硫優(yōu)點 a. 投資成本比 HDS低 50％，操作成本低1525％ b. 使用 BDS不會降解汽油中的辛烷 c. BDS不需要高溫高壓，可以減少能源消耗 d. 不產(chǎn)生 H2S等副產(chǎn)品 e. HDS促使汽油中的一些烯烴飽和，從而降低汽油的辛烷值 汽油脫硫前后含硫有機化合物的變化 汽油脫硫前后烴類物質(zhì)變化情況 5 10 15 20M i n u t e s0255075100125m V o l t sc : \ s t a r \ d a t a \ l i f u l i \ r e s u l t s \ 2 0 0 3 1 0 g a s o l i n e \ 8 。 3 7 。 2 8 1 0 f o l d z h e n l i u c k . r u n0255075100125m V o l t sc : \ s t a r \ d a t a \ l i f u l i \ r e s u l t s \ 2 0 0 3 1 0 g a s o l i n e \ 9 。 5 6 。 4 0 s a m 1 0 f o l d z h e n l i u . r u n脫前 脫后 4. 實際應用情況 ? BDS可廣泛用于處理汽油、餾分油、催化裂解原料油、渣油。 ? 采用 EBC新技術(shù)，還可以生產(chǎn)高價值化學品，增加脫硫的經(jīng)濟效益。 ? 休斯頓能源生物公司（ EBC）自從 1992年買斷了IGT的脫硫技術(shù)以來，約投資了 5,500萬美元用于研究，使生物脫硫技術(shù)有了長足的發(fā)展 。 BDS脫硫流程圖 轉(zhuǎn)化 BDS過程中間物獲得有價值的中間物 4. 實際應用情況 ? 目前 EBC正在進行著原油和汽油的 BDS技術(shù)研究。汽油 BDS工藝預計在 46年后實現(xiàn)工業(yè)化，目標是將汽油產(chǎn)品的硫含量降低到 50 pm以下。 ? EBC已向 Petro Star公司轉(zhuǎn)讓了 BDS技術(shù)，將在阿拉斯加州 Valdez煉油廠建成 250 kt/d的 BDS裝置。這將是第一套工業(yè)化規(guī)模的柴油 BDS裝置，處理量為 795 m3/d柴油，同時可產(chǎn)生新型芳香磺酸鹽產(chǎn)品。 謝謝