第8章-標記-資料下載頁
2025-08-15 23:09本頁面
【正文】 ARNA雜交及蛋白雜交等。 分子雜交的目的 就是運用特異的探針鑒定復雜的靶 DNA中同源的 DNA片段。 2022/8/27 海南大學農學院 wss65 Southern blot 1975年，英國科學家 Southern首創(chuàng)，是指 DNADNA雜交，是經典的基因分析方法。 原理和步驟 : 提取 DNA 限制酶消化 DNA片段 電泳分離 變性轉移至尼龍膜 變性、雜交 洗膜、放射自顯影、結果分析 2022/8/27 海南大學農學院 wss66 2022/8/27 海南大學農學院 wss67 斑點雜交 (dot and slot hybridization) 鑒定核酸序列的簡便方法。 原理及步驟 ：提取 Cell DNA ↓ 點樣品至膜、干燥、固定 ↓ 探針、 DNA變性、雜交 ↓ 洗膜、放射自顯影 ↓ 結果分析 2022/8/27 海南大學農學院 wss68 Northern blot ? 是指 RNA印跡法，應用特異性基因探針分析基因的轉錄水平。 原理及步驟： 提取 Cell 總 RNA ↓ 提純分離 mRNA ↓ 瓊脂糖凝膠電泳分離 RNA ↓ 轉移至硝酸纖維素膜 ↓ 雜交檢測 2022/8/27 海南大學農學院 wss69 Western 雜交印跡法 (Western bloting) ? 檢測蛋白質，即將電泳分離的非標記蛋白質轉移到固相載體上，用特異的抗血清對蛋白質進行鑒定及定量的方法。 ? 主要步驟： ? 蛋白質樣品的制備 ? SDS聚丙烯酰胺凝膠 (PAGE)電泳 ? 蛋白質的電轉移： NC膜 ? 靶蛋白的免疫學檢測 ? 靶蛋白于第一抗體（一抗）反應 ? 與標記的第二抗體（酶標二抗）反應 ? 顯色反應：酶促反應 2022/8/27 海南大學農學院 wss70 2022/8/27 海南大學農學院 wss71 （生物素標記 DNA探針測定） 非核素標記的核酸探針可采用印跡、反應和比色等步驟來評估每千個堿基對摻入的生物素或地高辛的數(shù)量。 2022/8/27 海南大學農學院 wss72 （非核素標記探針測定） ? 化學發(fā)光檢測也是近年來發(fā)展起來的檢測手段 ,它需要一定的發(fā)光增強劑 ,并配有各自的過氧化物酶系統(tǒng)。主要是生物素探針與固定在硝酸膜（或尼龍膜）上的DNA結合，生物素與親合素，過氧化物酶（或堿磷酶）結合，再經過化學發(fā)光及增強作用，將光量放大后，在 X片上發(fā)光自顯影，將特異結合的 DNA區(qū)帶顯示出來?；瘜W發(fā)光檢測敏感性高，但需要在暗室進行 X光片曝光，并且操作要速度，時間要掌握適度，這樣就增加了操作難度 。 2022/8/27 海南大學農學院 wss73 (一 ) 鑒定特異性目的基因及外源 DNA的檢測 在基因工程中，含有特異性目的基因的重組子，可通過核酸分子雜交進行鑒定。 生物工程產品中殘留的宿主細胞 DNA是一種潛在的與工藝相關的雜質。我們采用非同位素法，以長臂光敏生物素標記核酸探針，通過分子雜交檢測殘留 DNA。 四、應用 2022/8/27 海南大學農學院 wss74 (二 ) 基因診斷方面的應用 ? 以基因探針雜交和基因體外擴增兩項技術為主干，以轉印、電泳、限制性酶切乃至 DNA測序、基因拼接等技術為輔助，使基因診斷逐步成長為一套有廣泛用途的、高靈敏度、高特異性（能查明一個核苷酸的差異）的醫(yī)學生物學診斷手段，不同模式的基因診斷可以隨需要而任意選用。 2022/8/27 海南大學農學院 wss75 ? 例如：斑點或條狀雜交模式。 ? 適用于大批量標本的檢測，如普查、獻血員初篩等場合，每人每天的檢測可以達到 1000個標本以上，如果輔以半自動的樣品處理、分子雜交儀等檢測數(shù)則可增加數(shù)倍，對含多拷貝重復序列的瘧原蟲檢測可達高靈敏度。 2022/8/27 海南大學農學院 wss76 （三）表達抗體篩選 Antibody screening of ?GT11 expression clones
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