【導(dǎo)讀】培訓(xùn)特別規(guī)劃署及WHO人類生殖健康與研究部共同完成。我們對所有參與本手。冊籌備、編輯和校訂的人員表示誠摯的感謝。SouthAfrica)對本手冊編譯工作提供附注。衷心感謝國際男科學(xué)會提供的經(jīng)濟(jì)支持。GeoffreyWaites，他也是第二、第三和第四版實(shí)驗(yàn)室手冊的共同編輯。FMLPformyl-methionyl-leucyl-phenylalanine甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸

　　

【正文】 （每單位體積的數(shù)）有意義時(shí)，“精子密度（每單位體積的量）”一詞不應(yīng)使用。 精子計(jì)數(shù)的確定包括以下步驟（后續(xù)的細(xì)節(jié)章節(jié)有詳解）： 178。 在載玻片上涂抹液化后未稀釋的混勻精液樣本，覆上蓋玻片進(jìn)行檢驗(yàn)，以確定適于使用的稀釋度和計(jì)數(shù)池（見 ）。這即是通常用于鑒定活力的濕片（見 ）。 178。 將精液與加入固定劑的稀釋液混合。 178。 讓精液充填血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的一個(gè)計(jì)數(shù)池。 178。 10－ 15 分鐘內(nèi)評估樣本（干燥后會在數(shù)精池內(nèi)出現(xiàn)明顯精子痕跡）。 178。 每 次重復(fù)至少計(jì)數(shù) 200 條精子。 178。 比較每次重復(fù)的計(jì)數(shù)以了解其是否在可接受的誤差范圍。如是，則繼續(xù)計(jì)算；如否，則準(zhǔn)備新的稀釋。 178。 計(jì)算每 ml 精子密度。 178。 計(jì)算每次射精的精子總數(shù) 。 計(jì)數(shù)池類型 推薦使用 100μm 深血球細(xì)胞計(jì)數(shù)器為計(jì)數(shù)池，因 Neubauer（牛鮑氏）血球細(xì)胞計(jì)數(shù)器改良后的稀釋因素更適宜。使用另外深度的血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)池，有著不同的深度和網(wǎng)格模式，要求不同的計(jì)數(shù)因子。所使用的計(jì)數(shù)池對決定精子密度是有效的 (Seaman 等 , 1996。 Mahmoud 等 , 1997。 Brazil 等 , 2020b)，但改良后的Neubauer 血球細(xì)胞計(jì)數(shù)器得到的結(jié)果將會不同。通過毛細(xì)管作用填充的淺計(jì)數(shù)池，由于流動精子不會均勻分布 (DouglasHamilton 等 , 2020a, 2020b)。該誤差能夠被校正 (DouglasHamilton 等 , 2020a)，但校正并非是完全正確的 (Bj246。rndahl amp。 Barratt， 2020)。這種可選擇的計(jì)數(shù)池，其有效性須經(jīng)計(jì)數(shù)池核查量綱來確定 (見附錄 7, 節(jié) )，將 Neubauer 改良的血細(xì)胞計(jì)數(shù)器法得出的結(jié)果加以比較，獲得如客觀的質(zhì)量控制程序所顯 示出的滿意操作性能。為實(shí)現(xiàn)低密度精子的精確鑒定，需采用大容積的數(shù)精池 (見 )。 改良的 Neubauer（紐鮑爾氏）血球細(xì)胞計(jì)數(shù)器 改良的 Neubauer 血細(xì)胞計(jì)數(shù)器有兩個(gè)隔開的計(jì)數(shù)池，每個(gè)計(jì)數(shù)池均在玻片上gridlines 蝕刻出顯微鏡下可見的 3 mm 3 mm 模式，采用專用的厚載玻片 (厚度 4 32 號 , mm)，由 mm 玻璃柱支撐，覆蓋網(wǎng)格。每個(gè)計(jì)數(shù)區(qū)分成九個(gè) 1 mm 1 mm 網(wǎng)格。這些網(wǎng)格見圖 中數(shù)字所示。 圖 改良的 Neubauer（紐鮑爾氏）血球細(xì)胞計(jì)數(shù)器 蝕刻區(qū)略圖如下所示：血球細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)池的所有九個(gè)網(wǎng)格（左邊面板）；25 個(gè)大方格中的中央網(wǎng)格（ 5 號）（中間面板）；顯微鏡下已充填的一個(gè)數(shù)精池的部分（右邊面板），即中央網(wǎng)格的 25 個(gè)方格之一（中間面板的圓圈所示），其由三重線圍出，包含 16 個(gè)小方格。 血球細(xì)胞計(jì)數(shù)器網(wǎng) 格的使用 178。 只對整個(gè)精子（包括頭和尾）進(jìn)行計(jì)數(shù)。 178。 以精子頭部位進(jìn)行計(jì)數(shù)；尾的定向不重要；方格的邊界由三線的中間線標(biāo)明，所以，需統(tǒng)計(jì)精子頭的大部分是否位于兩條內(nèi)線之間，而并非大部分頭部在兩條外線之間 (圖 , 左面板 )。 178。 為避免毗鄰方格內(nèi)的同一精子的重復(fù)計(jì)數(shù)，頭部位于劃分兩個(gè)毗鄰方格的線上的精子，應(yīng)只計(jì)兩條垂直界線之一上的精子。例如，精子大部分的頭部低于 L 型 (見圖 , 中間面板 )中央界線或在其左邊的，可計(jì)數(shù)，而中央界線上方或右邊的不予計(jì)數(shù)（見圖 , 右邊面板）。 注意： 如果有頭部缺失的精子 尾（針頭）或無尾精子，在報(bào)告中應(yīng)記錄。若有需要，其濃度應(yīng)通過與正常精子計(jì)數(shù)同樣的方法進(jìn)行評估 (見 )，或其在精子中的比率可由染色法確定 (見 )。 計(jì)數(shù)器的維護(hù) 血球細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)池須用專用的厚蓋玻片 (厚度 4 號 , mm)。 178。 使用后，用水清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)器數(shù)精池和蓋玻片，然后用相機(jī)（鏡頭）專用紙充分干燥，這樣可避免干燥后的任何雜質(zhì)殘留。摩搓網(wǎng)格方格可除去先前樣本的任何殘留物。 178。 在消毒劑中過夜浸泡可重復(fù)使用的數(shù)精池和蓋玻片 (見附件 2, 部分 )，避免污染精液中潛在的 傳染因子 。 三線的中間線確定了方格的邊界（黑線，左邊面板）。除頭部在兩條內(nèi)線之 33 間（白圈）的精子之外，方格中央的所有精子均計(jì)數(shù)，但頭部在兩條外線之間的需計(jì)數(shù)（黑圈）。頭部大部分在中間線上的精子，如果該中線低于方格（白圈，中間面板）或是方格的左手線，則精子需計(jì)數(shù)，但如果該中線高于方格（黑圈，右邊面板）或是方格的右手線則不計(jì)數(shù)。 圖 網(wǎng)格方格內(nèi)計(jì)數(shù)的精子 稀釋后精液的固定 1． 1000mL 純水中溶解 50g NaHCO3和 10 ml 35% (v/v)甲醛溶液。 2．如果急需，加 g 臺盼藍(lán)（顏色所引 23859）或 5mL (4 mg/ml)飽和的結(jié)晶紫（顏色所引 42555），以加亮精子頭部。 3． 4176。C 貯藏。若溶液中是以結(jié)晶形式存在，使用前用 。 計(jì)數(shù)足夠數(shù)量精子的重要性 為降低樣本誤差，精子的臨界數(shù)量（大約 200 條重復(fù)計(jì)數(shù)時(shí) ，總數(shù) 400 條以上更合適）（見框 和表 ） 。 框 估計(jì)數(shù)值時(shí)的誤差 精子數(shù)目的估算精度依賴于所計(jì)數(shù)精子的數(shù)目。在泊松分布中，計(jì)數(shù)（ N）的標(biāo)準(zhǔn)誤差（ SE）是單位體積精液中精子數(shù)目的平方根（√ N），其 95%的置信區(qū)間（ CI）接近 N177。 179。 √ N（或?yàn)?N177。 2179。 √ N 左右）。 如果計(jì)數(shù) 100 個(gè)精子，那么標(biāo)準(zhǔn)誤差（ SE）即為 10（√ 100），其 95%的置信區(qū)間（ CI）是 80120（ 100177。 20）。如果計(jì)數(shù) 200 個(gè)精子，則 SE 為 14（√ 200），其 95%CI 為 172288（ 200177。 28）。如果計(jì)數(shù) 400 個(gè)精子，則 SE 為 20（√ 400），其 95%CI 為 360440（ 400177。 40）。 樣本誤差一般表達(dá)為計(jì)數(shù)的百分比（ 100179。（√ N/N））。詳見表 注意： 這些評估僅是大致，因?yàn)樵u估時(shí)可信度的間隔不會總是均勻?；诓此煞植嫉木_的 95%可信度間隔，一次計(jì)數(shù) 400 條時(shí)為 361441 條；一次計(jì)數(shù)100 條時(shí)為 – 121 條；一次計(jì)數(shù) 10 條時(shí)為 –；一次計(jì)數(shù) 1 條時(shí)為–；一次計(jì)數(shù) 0 條時(shí)為 –。 34 表 參照精子計(jì)數(shù)總數(shù)的圓形樣本誤差（ %） 注釋 1： 太少的精子用于計(jì)數(shù)，將會得出不可確信的結(jié)果（見附錄 7， 節(jié)），對診斷和治療產(chǎn)生影響 (見附錄 7, )。當(dāng)精子用于治療目的以及精子數(shù)量少時(shí)，這現(xiàn)象不可避免（見 節(jié)）。 注釋 2： 當(dāng)精液量少以及用于計(jì)數(shù)的精子少于推薦量時(shí)，所獲得的數(shù)據(jù)的精確度將顯著下降。如果每次重復(fù)少于 200 條 精子，報(bào)告樣本誤差見表 。 （廣西南寧第二醫(yī)院 生殖中心 劉峰） 35 常規(guī)計(jì)數(shù)程序 如果在計(jì)數(shù)池 5 和 6 大方格或是其中之一中有大約 200 條精子，那么按1 + 4 (1： 5) 和 1 + 19 (1： 20） 稀釋是合適的（見表 和 框 ）。 框 每次重復(fù)計(jì)數(shù)時(shí)改良紐鮑爾氏 計(jì)數(shù)池 中央 3 個(gè)大方格的精子數(shù)達(dá)到 200。 在初始的濕片制備中，如果容積為 4 nl 的 每 高倍視野（參閱 ）有 100 條精子，理論上精子密度為 25/ nl (25 000/μl 或 25 000 000 /ml)。 由于改良 紐鮑爾氏計(jì)數(shù)池的 中央大方格（ 5 號方格）容積是 100 nl，則其內(nèi)的精子數(shù)目將是 2500。以 1 + 4 (1: 5)倍數(shù)稀釋樣本將會調(diào)整每個(gè)大方格精子數(shù)量為 500，這樣可獲得足夠低的抽樣誤差。 在初始的濕片制備 中，如果每高倍視野有 10 條精子，則精子密度是 25/nl，中央大方格的精子數(shù)目是 建議以 1 + 1 (1: 2)倍數(shù)稀釋樣本將會調(diào)整每個(gè)大方格精子數(shù)量是 125。同樣，這可獲得足夠低的抽樣采樣誤差。 注： 由于計(jì)數(shù)的精子數(shù)目太少和計(jì)算的容積可能不太準(zhǔn)確，上述濃度計(jì)算只是粗略的估計(jì)。未稀釋精液樣本濃度估計(jì)大約是稀釋精液樣品計(jì)數(shù)濃度的 30％至130%。 確定所需的稀釋度 如果要準(zhǔn)確測量未稀釋精液樣本的精子數(shù)量，將精液予以稀釋是必要的，這種方法也通常用于在濕片制備中評測精子活力（請參閱 ）。 ? 如 ，估計(jì)每高倍視野 (179。 200或179。 400)的精子數(shù)。 ? 每高倍視野大約相當(dāng)于 16 nl (在 179。 200) 或 4 nl (在 179。 400）的容 積（請參閱 框 ）。 ? 如檢測到精子，則按照 的步驟 予以計(jì)數(shù)，并根據(jù)表 度。 ? 如果 檢測不到精子， 則檢測另一濕片。如果在第二張濕片中仍沒有 檢測 到精子，按照 。 框 池深為 20μ m的 濕片中每高倍視野的容積 36 每個(gè)顯微鏡檢測視野包含的精液量取決于該區(qū)域的面積（π r2，其中π大約是 ， r為顯微鏡檢測視野的半徑）和池的深度（濕片制備中大約是 m）。顯微鏡視野 的直徑可以用鏡臺微尺測量，或可以通過目鏡的光圈直徑除以物鏡的放大倍數(shù)來估算。 如使用179。 40的物鏡和口徑為 20 mm179。 10目鏡，則 顯微鏡視野 的直徑大約 500μ m(20 mm/40)。這種情形下， r = 250μ m， r2 = 62 500 μ m2， π r2 = 196 375 μ m2 ，而該區(qū)域的容積是 4 064 962 μ m3 或大約 4 nl。 如使用179。 20的物鏡和口徑為 20 mm179。 10目鏡，則 顯微鏡視野 的直徑大約是1000μ m(20 mm/20)。 這種情形下， r = 500μ m， r2 = 250 000μ m2， π r2 = 785 500μ m2， 而該區(qū)域的容積是 16 259 850μ m3 或大約 16nl。 表 精液所需稀釋度、配制方法、使用的計(jì)數(shù)板和評估區(qū)域 每 179。 400視野的精子數(shù) 每 179。 200視野的精子數(shù) 所需稀釋度 所需 精液量 （ μ l） 所需 固定液 （ μ l） 使用的 計(jì)數(shù)板 評估 區(qū)域 101 404 1： 20（ 1+19） 50 950 改良紐鮑氏 方格 6 16100 64400 1： 5(1+4) 50 200 改良紐鮑氏 改良紐鮑氏 215 860 1:2(1+1) 50 50 改良紐鮑氏 改良紐鮑氏 2 8 1:2(1+1) 50 50 改良紐鮑氏或更大容積 整塊玻片的9個(gè)方格 注 1： 白細(xì)胞移液管和依靠空氣置換原理的自動移液管并不足以將粘性精液準(zhǔn)確稀釋 ，建議使用正向置換型移液管。 注 2： 就診斷而言，用于分析的精液樣本不應(yīng)小于 50μ l，以避免因小容量樣本而造成的抽樣誤差。 注 3： 如在推薦的稀釋倍數(shù)下每視野可見的精子數(shù)目太少，則以更低的稀釋倍數(shù)制備另一個(gè)濕片。如在推薦的稀釋倍數(shù)下每視野有太多的重疊精子，則以更高的稀釋倍數(shù)制備另一個(gè)濕片。 注 4： 如果 1 + 19 (1: 20) 稀釋不合適，則使用 1 + 49 (1: 50)稀釋。 注釋 1： 如果初始濕片制備中精子數(shù)目太低 (每179。 400 高倍視野 4：大約 1179。106/ml)，此時(shí)可不要求計(jì)算準(zhǔn)確的精子數(shù)量 （請參閱 ）。 注釋 2： 為準(zhǔn)確評估低密度精子（ 每179。 400 高倍視野 2：大約 179。 106/ml)，建議對改良紐鮑爾氏計(jì)數(shù)池板的 9 個(gè)大方網(wǎng)格全部計(jì)數(shù)（ 請參閱 ），或使用 37 大容量的一次性計(jì)數(shù)板進(jìn)行熒光檢測（請參閱 ）。 稀釋精液并加樣于血細(xì)胞計(jì)數(shù)池 ? 吹打使血細(xì)胞計(jì)數(shù)池表面微微濕潤。 ? 將蓋玻片緊壓支持柱以固定于計(jì)數(shù)池上，可通過觀察兩層玻璃之間的虹彩（多 重 Newton 環(huán)）來確認(rèn)蓋玻片是否正確置放：光線越多，位置越 合適；如只有 12 條光線則提示計(jì)數(shù)池深淺不一。 ? 采用正向置換型移液管將適量的固定劑（見表 ）分配到兩個(gè)稀釋瓶中。 ? 將精液樣本混勻（ 請參閱 框 ） 。 ? 混勻后立即吸入適量的精液，以避免精子從懸浮液中沉降（ 見表 ）。 ? 將移液管尖端的精液擦拭干凈，小心以避免碰到尖端的開口。 ? 將精液加入固定劑中，反復(fù)吸壓以洗刷移液管尖頭部。 ? 重新將精液樣本混勻，按以上步驟重復(fù)另一份稀釋。 ? 將第一次稀釋的液體置于振蕩器以最高的速度振蕩 10 秒鐘以充分混勻，立即吸取 大約 10181。l 的懸浮液以避免精子 沉降。 ? 將移液管尖端仔細(xì)觸碰其中一個(gè)計(jì)數(shù)池 v 型槽