病毒感染細(xì)胞實(shí)驗(yàn)整體流程及原理docxdocx-資料下載頁
2025-07-18 12:42本頁面
【正文】 n內(nèi)不能關(guān)閉，否則影響顯微鏡壽命），細(xì)胞培養(yǎng)板置于載物臺，調(diào)節(jié)物鏡和光圈，先用自然光觀察視野內(nèi)細(xì)胞，再關(guān)閉光，開啟熒光通道，觀察熒光強(qiáng)度，判定感染率。圖片取樣前可以調(diào)節(jié)曝光時間，增益值和彩色度使熒光照片最完美。（針對leica）注意事項內(nèi)容，太少的話細(xì)胞被感染的也少，但是病毒濃度太大，對細(xì)胞有傷害。，以保證病毒的濃度，在培養(yǎng)10h左右可根據(jù)培養(yǎng)基顏色加培養(yǎng)基。，可進(jìn)行濃度梯度感染，計算細(xì)胞感染復(fù)數(shù)。24h左右可換液，48小時即可看熒光，具體時間根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)來看。感染后的細(xì)胞檢測方法熒光初步檢測若有熒光，則表示病毒感染成功，但并不能確定目的基因是否整合到細(xì)胞中，待進(jìn)一步檢測，熒光有強(qiáng)弱之分，與病毒加入的量有關(guān)。的提取及RTPCR檢測原理因?yàn)檎婧思?xì)胞DNA含有很多非編碼區(qū)，真核生物的DNA轉(zhuǎn)錄成為RNA之后，經(jīng)過剪切和拼接，去掉這些非編碼區(qū)，才能形成真正的mRNA，是否表達(dá)真核生物的基因并表達(dá)相應(yīng)的蛋白，只能通過提取其mRNA并RTPCR這條途徑來測定提取步驟加1mlTrizol，吹打后移至無菌的離心管中；加100ul氯仿劇烈振蕩30s混勻，12000轉(zhuǎn)15min，可看到明顯分層；取上層透明液體至新的離心管中，加等體積的異丙醇，混勻靜置10min，12000轉(zhuǎn)離心10min，棄上清，加1ml70%乙醇，12000轉(zhuǎn)，離心10min，棄上清，風(fēng)干剩余液體，最后加DEPC水溶解RNA，電泳，粗步判定RNA純度。步驟：RT是一個逆轉(zhuǎn)錄的過程，用前一天提取好的總RNA，在加入引物，模版和酶，并在PCR儀的溫度設(shè)置下，RNA可逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR是cDNA在模版，引物，酶的作用下進(jìn)行復(fù)制成雙鏈DNA。（具體步驟省略）蛋白提取及Western檢測westernBloting：蛋白免疫印跡（Westernblotting 或Immunoblotting）一般由凝膠電泳、樣品的印跡和免疫學(xué)檢測三個部分組成。第一步是做SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，使待測樣品中的蛋白質(zhì)按分子量大小在凝膠中分成帶。第二步把凝膠中已分成條帶的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到一種固相支持物上，用得最多的材料是硝酸纖維素膜(NC膜)和PVDF膜，蛋白轉(zhuǎn)移的方法多用電泳轉(zhuǎn)移（轉(zhuǎn)移電泳），它又有半干法和濕法之分，現(xiàn)在大多用濕法。第三步是用特異性的抗體檢測出已經(jīng)印跡在膜上的所要研究的相應(yīng)抗原。免疫檢測的方法可以是直接的和間接的?，F(xiàn)在多用間接免疫酶標(biāo)的方法，在用特異性的第一抗體雜交結(jié)合后，再用酶標(biāo)的第二抗體（堿性磷酸酶（AP）或辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的抗第一抗體的抗體）雜交結(jié)合，再加酶的底物顯色或者通過膜上的顏色或X光底片上暴光的條帶來顯示抗原的存在。該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蛋白表達(dá)水平的檢測
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