【正文】 CL6B,Pharmecia產(chǎn)品。CA19CA125和CA153參考標(biāo)準(zhǔn)，AFP和CEA CLIA藥盒，CIBACORNING產(chǎn)品。牛IgG自制。去離子超純水由本室采用Barnsteed公司超純水器（D7033）制備。96孔微扎板，Nunc產(chǎn)品。BSA，上海生物制品的產(chǎn)品。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。全自動IFMA檢測儀（Auto DELFIA1235）為EG＆GWellac產(chǎn)品。全自動ＣＬＩＡ檢測儀（ＡＣＳ１８０）為ＣＩＢＡＣＯＲＮＩＮＧ產(chǎn)品。１．２方法?。桑疲停粒ǎ保┕滔郈17和Eu3+－C５０制備：將C17單抗用５０nmol/L Na2CO3NaHCO3 。每孔加200ul,4℃放置過夜。Eu3+－C５０制備參照Eu3+標(biāo)記盒進(jìn)行。每個C５０IgG上連接了13個Eu3+，%。（2）測定方法：用含8mmol/L NaCI,%BSA,%牛IgG，50umol/LDTPA,，,即在包被有C17的96孔微孔板上,每孔依次加入25ul CEA參考標(biāo)準(zhǔn)或待測血清及200ul反應(yīng)緩沖液,37℃振蕩孵育2h后,用洗滌液洗4次。再加200ul1:1000稀釋的Eu3+－C５０，37℃孵育1h，洗滌6次，加入增強(qiáng)液200ul,370170反應(yīng)5min,熒光檢測。全部過程在Auto DELFIA1235上自動完成。 AFP IFMA (1)固相C47和Eu3+－C137制備：方法同上，+，%。（2）測定方法：反應(yīng)緩沖液和洗滌液同上。采用固相二步順序夾心法建交AFPIFMA，C47包被板每孔依次加入25ul AFP參考標(biāo)準(zhǔn)或待測血清及200ul反應(yīng)緩沖液，37℃孵育1h后，加200ul：1000稀釋的Eu3+－C５０，孵育1h。后續(xù)方法同上。 CEA和AFP CLIA 參照藥盒說明書，全部過程均在ACS180上自勸完成。2 結(jié) 果 IFMA ,CEA IFMA的靈敏度為90ng/L；AFP對本法無交叉反應(yīng)，%；%%。%，～。 AFP IFMA ,AFP IFMA的靈敏度為43ng/L；CEA、CA12CA153和CA199對方法無交叉反應(yīng)；%%。%；～1210ul/L。 IFMA與CLIA同步比較 137例正常人經(jīng)CEAMA和CLIA測量,結(jié)果高度相關(guān)(r=)。148例正常人經(jīng)AFP IFMA 和CLIA測量，結(jié)果相符（r=）。3 討 論 以往超微量免疫分析技術(shù)應(yīng)用的普遍問題是穩(wěn)定性難以滿足于臨床工作的需要。鑒于放射性同位素示蹤劑自身衰變或保存條件苛刻及自分解變性失活等原因［3］，對于RIA和IRMA等方法，每次分析，即使單樣品檢測也必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線相對測量的依據(jù)。EIA本身方法學(xué)的原因，不能完全定量［4］。我們建立的AFP和CEA IFMA同批試劑連續(xù)5個月臨床應(yīng)用分析，標(biāo)準(zhǔn)曲線基本重合，無明顯漂移。可以用同批試劑單次標(biāo)準(zhǔn)曲線作為今后分析的固定參考曲線。CIBACORNING的CLIA試劑盒也同樣可重復(fù)且穩(wěn)定。就IFMA和CLIA經(jīng)臨床同步比較，結(jié)果相關(guān)性好。同時我們也與我們自己的IRMA比較，結(jié)果也高度相關(guān)，說明上述兩種方法可取代以往的AFP和CEA分析方法。從方法學(xué)的考核情況看，多數(shù)指標(biāo)與IRMA類同，但方法學(xué)穩(wěn)定性顯著優(yōu)于IRMA。就IFMA與CLIA臨床比較方面，后者檢測速度明顯優(yōu)于前者，可作臨床急診診斷。而前者適合大批量的樣品檢測，穩(wěn)定性更高，可測范圍更寬，理論分析靈敏度更高。尤其是鑭系元素多標(biāo)記技術(shù)的研究開發(fā)，使IFMA有可能成為象生化分析儀樣的一次分析多個分析結(jié)果產(chǎn)生的前景。 ［參考文獻(xiàn)］［1］ NIH consensus antigen:It is role as marker in the management of cancer ［j］.Cancer Res,1981,41:2017. ［2］Suonpaa MU,Lavi JT,Himmila new sensitive assay of human alphlfetoprotein using timeresolved fluorescence and monoclona antibodies ［j］.Clin Chim Acta,1985,145,341348［3］Rosalyn S, radioimmunoassay［j］.中華核醫(yī)學(xué)雜志，1989，9：1 ［4］ 黃 飚，浦洪波，朱寒珍，［j］.核技術(shù),1995,18:699 甲胎蛋白時間分辨熒光免疫分析 黃飚 肖華龍 朱利國 譚成 蔡剛明 金堅(jiān) 近年發(fā)展的時間分辨熒光測量技術(shù)以稀土離子為示蹤材料，具有測量靈敏度高、操作簡便、示蹤物穩(wěn)定、定量分析量程寬、無放射性污染和應(yīng)用范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)。我們采用時間分辨熒光測量技術(shù)，建交了AFP時間分辨熒光免疫分析（ timeresolved fluoroimmunoassay,TRFIA）。一、 材料與方法 材料與試劑：抗AFP單克降抗體A137和A47由無錫第二制藥廠提供。Eu3+標(biāo)記盒、Eu3+發(fā)光增強(qiáng)液、AFP TRFIA藥盒和AFP參考標(biāo)準(zhǔn)，EG＆GWallac產(chǎn)品。CA19CA125和CA153參考標(biāo)準(zhǔn)，CIBACORNING產(chǎn)品。AFP質(zhì)量控制血清（L：M：62～93ug/L；H：～）,中國藥品生物制品鑒定所產(chǎn)品。全自動TRFIA檢測儀（Auto DEL FIA1235）為EG＆GWallac產(chǎn)品。 固相抗體制備：將A47單抗用50mmol/L Na2CO3NaHCO3 ，微孔板各孔加200ul，4℃放置過夜。BSA封閉后真空抽干，板條密封后置20℃冷凍保存。 Eu3+ A137制備：參照Eu3+標(biāo)記盒說明書操作。（2g/L）+N2［p異氰酸芐基］二乙烯三胺四乙酸（Eu3+DTTA）凍干粉的小瓶中，30℃磁力攪拌反應(yīng)20h。反應(yīng)液經(jīng)用80mmol/L TrisHCI CL6B柱（1cm40cm）層析，A280監(jiān)測收集蛋白峰。 測定方法：采用平衡法建交AFPTRFIA，即在包被在A47的96孔微孔板上，每孔依次加入25ul AFP參考標(biāo)準(zhǔn)或待測血清， 200ul以反應(yīng)緩沖液1：1000稀釋的Eu3+ A137，25℃振蕩孵育1h后，用洗滌液洗滌6次。再加增強(qiáng)液200ul,25℃振蕩反應(yīng)5min，熒光檢測。全部過程均在Anto DELFIA 1235上自動完成，軟件設(shè)置由本所自編。 數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)處理：AFPTRFIA標(biāo)準(zhǔn)曲線由Anto DEFIA 1235自帶的LogLogit函數(shù)處理。精密試圖和可測范圍分析用吳德福IRMA數(shù)據(jù)處理軟件。統(tǒng)計(jì)黨處理用t檢驗(yàn)。二、 結(jié)果 Eu3+ A137的理化和免疫學(xué)鑒不定期：Eu3+ A137以EG＆GWallac提供的Eu3+標(biāo)準(zhǔn)為參考，+，%。選擇AFP參考標(biāo)準(zhǔn)高點(diǎn)（1000ul/L）, Eu3+ A1371:1000稀釋，進(jìn)行TRFIA，Bmax/%.與低點(diǎn)（1ug/L）的發(fā)光計(jì)數(shù)差達(dá)2個數(shù)量級以上。被測物和反應(yīng)發(fā)光計(jì)數(shù)基本成算術(shù)級數(shù)正比關(guān)系。 AFP=TRFIA的考核：經(jīng)LogLogit函數(shù)處理程序處理得AFPTRFIA標(biāo)準(zhǔn)曲線。（1）方法的特異性：將CEA、CA19CA125和CA153分別配成10～500U/ml、～409U/ml、～732U/～243U/ml一系列不同濃度，代替標(biāo)準(zhǔn)曲線中的AFP參考標(biāo)準(zhǔn)。在上述范圍內(nèi)，CEA、CA19CA125和CA153對AFPTRFIA均無均交叉反應(yīng)。（2）精密度和回收率：%%，～1210ul/L,%。（3）靈敏度和穩(wěn)定性：。8條不同時間進(jìn)行的AFPTRFIA的效點(diǎn)均值EDED50和ED80分別為（177。）ul/L、（177。）ul/L和（177。）ul/L。三、 討論 TRFIA 測量儀已進(jìn)入第在代，分析技術(shù)已實(shí)現(xiàn)高度自動化。我們所建方法適于測量血清AFP的含量，Eu3+ A137經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線比較鑒定，免疫反應(yīng)性基本無損失；其凍干品30℃保修13個月后免疫反應(yīng)參數(shù)基本未改變。用國家指定的AFP質(zhì)控血清作樣品進(jìn)行分析，L、M和H分別為：、符合質(zhì)控要求。我們曾把高含量的AFP血清樣品經(jīng)1：10～1000稀釋后用于本方法的測定，換算后的AFP含量非常接近；用該系列稀釋血清代替AFP參考標(biāo)準(zhǔn)曲線，其斜率與AFP的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率基本一致，表明AFPTRFIA有良好的健全性，血清基質(zhì)對本方法沒有明顯影響。8孔重復(fù)4組參考標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)的ABCV均＜%，批內(nèi)及批間重復(fù)性研究亦證明本方法是可靠的。以往超微量免疫分析技術(shù)每次分析，即使單樣品檢測也必須做標(biāo)準(zhǔn)曲線作相對測量的依據(jù)。我們建交的AFPTRFIA同批試劑連續(xù)5個月就用分析，發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線基本重合，無明顯漂移，可以用同批試劑單次標(biāo)準(zhǔn)曲線為今后分析的固定參考。這既可減輕臨床應(yīng)用的工作強(qiáng)度，又可提高藥盒的經(jīng)濟(jì)價值。 AFPTREIA受檢血清用量僅為RIA或IRMA的四分之一，有利于減少樣品分析系統(tǒng)的干擾，也有助于節(jié)約樣品，便于多指標(biāo)分析。AFPTRFIA的分析時間僅為1h，且分析系統(tǒng)高度自動化，這樣可提高臨床檢驗(yàn)結(jié)果的速度，又可大幅度降低人為誤差和增加檢出結(jié)果的可靠性。30 / 30