【正文】 0%NaCl處理3h、6h后miR097的相對(duì)表達(dá)量變化情況圖232 5%、20%NaCl處理3h后miR168的相對(duì)表達(dá)量變化情況圖233 5%、20%NaCl處理6h后miR168的相對(duì)表達(dá)量變化情況圖234 5%NaCl處理3h、6h后miR168的相對(duì)表達(dá)量變化情況 圖235 20%NaCl處理3h、6h后miR168的相對(duì)表達(dá)量變化情況圖236 10%、20%NaCl處理3h后miR198的相對(duì)表達(dá)量變化情況圖237 5%、20%NaCl處理6h后miR198的相對(duì)表達(dá)量變化情況圖238 20%NaCl處理3h、6h后miR198的相對(duì)表達(dá)量變化情況 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與結(jié)果分析 trizol法提取的總RNA的OD值分析及討論我們可以看到trizol法提取的總RNA濃度較高。因?yàn)閷⒖俁NA溶于DEPC水，所以低離子濃度下A260/，表明純度較高。 trizol法提取的總RNA的電泳結(jié)果分析及討論根據(jù)總RNA電泳結(jié)果可知，28s、18sRNA 2條帶較為清晰，條帶邊緣較為齊整，表明總RNA較少分解、完整度較高，可以用來實(shí)時(shí)定量PCR。 實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果分析及討論一般情況下，測(cè)序得到的miRNA 需要進(jìn)行Northern Blot驗(yàn)證或者通過實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證。傳統(tǒng)的Northern Blot驗(yàn)證步驟簡(jiǎn)便，證據(jù)直接。通常的Northern Blot探針有兩種標(biāo)記方法：（1）地高辛（Digoxin，DIG）標(biāo)記法；（2）同位素標(biāo)記法。與Northern Blot相比，通過Real Time PCR 技術(shù)對(duì)miRNA的驗(yàn)證既可以省去大量的預(yù)雜交與雜交時(shí)間，又可以對(duì)被檢測(cè)的miRNA有一個(gè)直觀的、定量的檢測(cè)。高效、精確的Real Time PCR技術(shù)已被廣泛用來對(duì)于miRNA的檢測(cè)。傳統(tǒng)的定量PCR技術(shù)主要用來擴(kuò)增80200bp的DNA片段。對(duì)于通常長(zhǎng)度只有20nt左右的miRNA 來說，傳統(tǒng)的定量PCR 技術(shù)只能用來測(cè)定miRNA 前體的片段。因此，實(shí)驗(yàn)在對(duì)miRNA進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)時(shí)，通過小RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)miRNA的末端添加了一段80nt左右的尾巴序列，這樣就得到了一段帶有miRNA序列的一段100nt序列，通過擴(kuò)增這一段100nt的序列得到了miRNA 的序列。根據(jù)Real time PCR 的原理可知，出現(xiàn)單峰溶解峰的可能為真正的Micro RNA，而那些出現(xiàn)雙峰溶解峰的待檢測(cè)Micro RNA 因?yàn)橛蟹翘禺愋詳U(kuò)增，可能不是真正的Micro RNA。經(jīng)過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)之后發(fā)現(xiàn)，mirNaCl00mirNaCl09mirNaCl16mirNaCl198是真正的Micro RNA。mirNaCl041驗(yàn)證為假的RNA。 相對(duì)表達(dá)量的柱狀圖分析分析公式：ΔCT=樣品CT—內(nèi)參CT ΔΔCT=ΔCT脅迫—ΔCT對(duì)照 取—ΔΔCT或2—ΔΔCT 為柱狀圖縱坐標(biāo)當(dāng)各—ΔΔCT值差異較為明顯，做出的柱狀圖可以清楚的看到變化趨勢(shì)時(shí)，可直接采用—ΔΔCT值為縱坐標(biāo)作圖，其意義為：—ΔΔCT 0時(shí)上調(diào)表達(dá)，—ΔΔCT 1時(shí)顯著上調(diào)表達(dá)，—ΔΔCT 0時(shí)下調(diào)表達(dá)，—ΔΔCT —1時(shí)顯著下調(diào)表達(dá)。當(dāng)各—ΔΔCT值差異不明顯，做出的柱狀圖可以不能清楚的看到變化趨勢(shì)時(shí)，可以借助數(shù)學(xué)上指數(shù)函數(shù)離散性較快的特點(diǎn)，采用2—ΔΔCT為縱坐標(biāo)作圖，其意義為：2—ΔΔCT 1時(shí)上調(diào)表達(dá)，2—ΔΔCT 2 時(shí)顯著上調(diào)表達(dá)，2—ΔΔCT 1下調(diào)表達(dá)，2—ΔΔCT 。① 5%、3h處理時(shí)miR003顯著上調(diào)表達(dá)（—ΔΔCt=），20%、3處理時(shí)miR003下調(diào)表達(dá)（—ΔΔCt=—）。20%、3h處理時(shí)miR003顯著上調(diào)表達(dá)（—ΔΔCt=），20%、6h處理時(shí)miR003也上調(diào)表達(dá)，但上調(diào)幅度相對(duì)較?。āうt=）。我們可以看出，圖219和圖220都有相同趨勢(shì)，miR003的上調(diào)表達(dá)的幅度隨著處理濃度的增加而減少。圖221和圖222都有相同的趨勢(shì)，miR003的上調(diào)表達(dá)的幅度隨著處理時(shí)間的增加而增加。根據(jù)以上結(jié)果可知，miR003的靶基因在較低濃度鹽處理下，表達(dá)量快速下降以響應(yīng)脅迫，在較高濃度鹽處理下表達(dá)量無大幅度變化，推測(cè)植物對(duì)低濃度和高濃度鹽脅迫的響應(yīng)機(jī)制不同，miR003和其靶基因主要參與了較低濃度下鹽脅迫植物的響應(yīng)過程。而隨著時(shí)間的推移，植物受脅迫危害越來越重，miR003的表達(dá)自然隨之上升。② miR041的實(shí)時(shí)定量PCR融解峰出現(xiàn)雙峰，在此不做柱狀圖的分析。③ 5%、3h處理，10%、3h處理和20%，3h處理時(shí)miR097的表達(dá)量都顯著上升（—ΔΔCt＞4），并且上調(diào)表達(dá)的幅度隨處理濃度增加而增加。5%、6h處理時(shí)的miR097表達(dá)量有小幅下降，10%、6h處理和20%，6h處理時(shí)的miR097表達(dá)量也都顯著上升，上調(diào)表達(dá)的幅度也隨處理濃度增加而增加。根據(jù)柱形圖趨勢(shì)分析，5%、6h處理時(shí)的miR097表達(dá)量數(shù)據(jù)可能不準(zhǔn)確，需要重新進(jìn)行驗(yàn)證。由柱狀圖可知隨著NaCl濃度的增加miR097表達(dá)量也增加，說明miR097參加了低濃度和高濃度的脅迫響應(yīng)機(jī)制，來抑制靶基因的表達(dá)。圖22圖2圖231都有相同的趨勢(shì)，說明miR097表達(dá)量隨著處理時(shí)間的推移而下降?？赡苁谴藭r(shí)有其他的響應(yīng)機(jī)制開啟從而miR097靶基因表達(dá)量上調(diào)，也可能是miR097靶基因編碼的產(chǎn)物非常重要，不能持續(xù)過長(zhǎng)時(shí)間的下調(diào)表達(dá)，否則會(huì)對(duì)植物產(chǎn)生不可逆的損傷。④由圖23233可知在相同處理時(shí)間不同處理濃度下，看不出miR168表達(dá)量的變化規(guī)律。但圖23235的變化趨勢(shì)相同，由柱狀圖可知，無論是高濃度處理還是低濃度處理，miR168表達(dá)量均隨著時(shí)間推移而下調(diào)，證明其靶基因在鹽脅迫響應(yīng)的后期，可能有一定的作用。⑤ miR198的實(shí)時(shí)定量PCR數(shù)據(jù)柱狀圖趨勢(shì)有較多矛盾之處，可能是由于實(shí)時(shí)定量PCR時(shí)點(diǎn)樣不均或反轉(zhuǎn)錄時(shí)有部分RNA降解。故miR198的數(shù)據(jù)不可信，需以后實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析驗(yàn)證。參考文獻(xiàn)[1]Boyer,J. S..Plant productivity and environment[J].Science,1982,218(4571):443448.[2][D].海南,海南大學(xué),2010.[3]張建樹,于學(xué)文,[M].北京:科學(xué)出版社,2006:123[4][5][M].陳月琴,:科學(xué)出版社,2010:196241.[6]楊榮武,鄭偉娟,[M].南京:南京大學(xué)出版社,2007:313346.[7]Jan Barciszewski,Volker A. [M].:科學(xué)出版社,2008:104120.[8]尤永龍,林丹軍,[M].北京:科學(xué)出版社,2011:149178[9]楊晶,胡剛,[M].北京:科學(xué)出版社,2010:213231.[10]趙可夫,李法曾,[M],北京：科學(xué)出版社,2013:1123.[11]劉友,[M].北京:科學(xué)出版社,1998:752769.[12]賈庚祥,[J].植物學(xué)通報(bào),2002,19(3):272279.[13][J].井岡山師范學(xué)院學(xué)報(bào),2005,25(5):2328.[14]郭房慶，黃昊，[J].植物生理學(xué)報(bào),1999,25(4):395400.[15]郭澤建,[J].植物學(xué)報(bào),2000,42(9):881891.[16]金龍國(guó),王川,[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2006, 22(8):609614.[17]李培武,趙永國(guó),[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,38(7):13461352.[18]李彥,張英鵬,2008,1(24):258265.[19]閻勇,羅興錄,[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2007,23(9):323326. [20]張明生,杜建廠,[J]. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2004,27(4):122125.[21]趙可夫,盧元芳,+對(duì)小麥幼苗降低鹽害效應(yīng)的研究[J].植物學(xué)報(bào),1993,35(1):5156.[22]Allen E,Xie Z,Gustafson phasing during transacting siRNA biogenesis in plants[J].Cell,2005,121(2):207221.[24]Berezikov E,Guryev V,van de Belt shadowing and putational identification of human microRNA genes[J].Cell,2005,120(1):2124.[25]Carrington J C, Ambros of microRNAs in plant and animal development[J]. Science,2003,301(5631):336228.附錄1 縮略詞RISC：沉默復(fù)合體SNP：硝普鈉AM：叢枝菌根CAT：過氧化氫酶ABA：脫落酸SOD：超氧化物歧化酶POD：過氧化物酶DNA：脫氧核糖核酸RNA：核糖核酸ORF：可讀框或開放閱讀框附錄二 realtime CT值CT值miR003miR041miR097miR168miR1985%,3h,NaClNA10%，3h, NaClNA20%,3h, NaCl5%,6h,NaCl10%,6h,NaClNANANA20%,6h,NaClCk致謝時(shí)光飛逝如白駒過隙，大學(xué)四年生活即將畫上圓滿的句號(hào)。過去的四年使我獲益良多。在學(xué)習(xí)上，對(duì)專業(yè)知識(shí)有了更深的了解。在思想與生活上也取得了一定的進(jìn)步。這四年的時(shí)光，印記了我精彩人生中的一劇刻骨銘心的寶貴經(jīng)歷。在此，我向過去的四年里在學(xué)習(xí)、生活中給我?guī)韼椭娜藗儽硎菊\(chéng)摯的感謝。首先，我要感謝我的論文導(dǎo)師武永軍副教授。從論文的選題到體系的安排，從觀點(diǎn)推敲到字斟句酌，無不凝聚著武老師的心血。他嚴(yán)肅的科學(xué)態(tài)度、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)精神、精益求精的工作作風(fēng)，深深地感染和激勵(lì)著我。感謝武永軍老師在畢業(yè)設(shè)計(jì)期間提供的寶貴學(xué)習(xí)環(huán)境及在課題研究中給予的指導(dǎo)、在實(shí)驗(yàn)中以及論文撰寫和修改中給予的意見和建議。武老師的寶貴指導(dǎo)是本論文得以完成的基礎(chǔ)。其次我還要感謝本實(shí)驗(yàn)室的李鶴松、王維嘉、李龍、楊應(yīng)棟等同學(xué)在實(shí)驗(yàn)過程中的合作與幫助。有了他們的合作，實(shí)驗(yàn)才得以更加順利的完成。最后，我要感謝我的父母、家人、同學(xué)對(duì)我一如既往的支持，正是依靠他們的鼓勵(lì)與支持才能使我能夠安心求學(xué)、順利完成學(xué)業(yè)。我的畢業(yè)論文離不開老師、親人及朋友在這四年來對(duì)我的付出和關(guān)照，我再次向他們表示最誠(chéng)摯的感謝和最崇高的敬意。 謝璽2014年6月3日42