【正文】 DNA、抗體/抗原、酶、微生物細胞等）作為識別分子，把生物、化學(xué)反應(yīng)的高選擇性和壓電石英晶體對質(zhì)量變化的靈敏性結(jié)合在一起而形成的一種新型傳感器。通過壓電介質(zhì)激發(fā)的聲波與周邊環(huán)境的相互作用，傳感器能將生化反應(yīng)過程中石英晶體表面和體系性狀的變化轉(zhuǎn)換為可定量檢測的頻率信號。它可分為質(zhì)量響應(yīng)型和非質(zhì)量響應(yīng)型兩大類。壓電生物傳感器具有以下特點：質(zhì)量響應(yīng)靈敏、特異性高、簡便快速、樣品無需標(biāo)記、方法易于自動化、集成化。 1983 年 Giuilbault 等人 [54]報道了一個檢測甲醛氣體的酶壓電晶體生物傳感器，它是在一個基頻為 9MHz 的切割石英晶體表面涂上一薄層甲醛脫氫酶及輔酶因子而制成。當(dāng)通入含有甲醛的空氣時，晶體表面發(fā)生以下反應(yīng):電子科技大學(xué)博士學(xué)位論文4酶 + 輔 酶 因 子 ＋ 甲 醛 復(fù) 合 物 產(chǎn) 物如果控制反應(yīng)時間在 1 min 以內(nèi)，則僅有復(fù)合物而無產(chǎn)物形成，石英晶體的頻差只取決于吸附在晶體上的甲醛的質(zhì)量并與空氣中甲醛濃度相關(guān)。該生物傳感器具有較好的選擇性，常見的醇、醚不干擾甲醛的測定。Yasushi 等人 [55]報道了檢測乙醇和 James[56]報道了檢測二氧化碳的壓電晶體生化傳感器，這兩種物質(zhì)含量的檢測在臨床醫(yī)學(xué)中具有重要意義。由于免疫反應(yīng)的特異性、抗體一抗原結(jié)合物的異常穩(wěn)定性及抗體(或抗原)的分子量較大，這些優(yōu)點正好滿足了壓電晶體生物傳感器的要求，并使得免疫壓電晶體生物傳感器已成為壓電晶體生物傳感器發(fā)展的主流。Prusak Sochaczewski等人 [57]研制了一個可檢測生物懸浮液中的鼠傷寒沙門氏菌的壓電晶體免疫生物傳感器。此外，檢測細菌的免疫壓電晶體生物傳感器也有報道 [5859]。 壓電晶體生物傳感器具有較高的靈敏度( ng 級)、較好的選擇性及響應(yīng)快速等特點，既能用于液相環(huán)境又能用于氣相環(huán)境，并有可能發(fā)展成無線遙測式生物傳感器 [60]。今后，隨著免疫酶技術(shù)在壓電生物傳感器上的應(yīng)用，以及無線遙測壓電生物傳感器研究的深入，壓電生物傳感器將成為生物傳感器中最活躍的領(lǐng)域之一。 光纖生化傳感器光學(xué)生物傳感器不但可以高靈敏地檢測生物樣品的吸光及化學(xué)發(fā)光，還可以進行精細免疫化學(xué)分析。使用光電設(shè)備可制備微小型、綜合型的廉價光學(xué)生物傳感器。光學(xué)生物傳感器中發(fā)展最迅速的是光纖型生物傳感器，它除靈敏度高、尺寸小、制作使用方便外，還在于檢測中不受外界電磁場的干擾。光纖化學(xué)傳感器是指安裝在光纖端部（FOCS）的試劑相裝置, 如果將 FOCS 的試劑相換成生物活性物質(zhì), 如酶、DNA 或 RNA 片段、抗原抗體、微生物、組織和細胞器等就構(gòu)成了光纖生物傳感器。生化反應(yīng)所導(dǎo)致分子探針的光學(xué)性質(zhì)(光的波長、光強、偏振或折射等性質(zhì))的變化會通過光纖反饋至監(jiān)測系統(tǒng), 由計算機自動顯示或打印結(jié)果。 自從 1980 年 Peterson 等人 [61]報道光纖 pH 生物傳感器以來，由于具有非電特征、機械柔韌性和不必采用麻煩的參比電極等的諸多優(yōu)點，光纖生物傳感器發(fā)展較為迅速。1997 年 Marazuela 等人 [62]報道基于熒光指示劑的光纖 pH 生物傳感器，第一章 緒論5展示了光纖生物傳感器在人體內(nèi)應(yīng)用的前景。Xie 等 [63]描述了一種基于用 8羥基芘1,3,6三磺酸鈉 (HPTS)作為指示劑的熒光光纖尿素傳感器。陳堅等 [64]選用芘丁酸(PBA)等脂溶性熒光試劑作為分子探針,加入符合設(shè)計要求的固相支持劑和增塑穩(wěn)定劑,采用溶劑揮發(fā)鑄膜法制備 厚度的膜片,裝置在石英光導(dǎo)纖維端部即形成芘丁酸光纖化學(xué)膜傳感器(PBAFOCS) [6566]。美軍在 1986 年生物戰(zhàn)防護研究計劃中證實用光纖生物傳感器可檢測病毒和細菌戰(zhàn)劑 [6768]，他們使用抗體或受體光纖波導(dǎo)生物傳感器來檢測生物毒素和病原微生物，15 min 即可得出結(jié)果。這種光纖免疫生物傳感器不僅體積小，而且可遠距離操作。這種新型光纖免疫生物傳感器有著無限的應(yīng)用前景。 聲表面波生化傳感器聲表面波(SAW) 器件是一種新型的聲學(xué)壓電器件，它是利用壓電效應(yīng)和逆壓電效應(yīng)把聲波在壓電晶體表面?zhèn)鞑サ淖兓D(zhuǎn)換為電信號而被檢測的。壓電晶體中的粒子在受到外界應(yīng)力(剪切力和壓縮力)的作用下發(fā)生彈性振動，振動以聲波的形式在固體表面或體內(nèi)傳播。由于壓電效應(yīng)的存在，可以利用金屬換能器把電信號轉(zhuǎn)換為相應(yīng)(幅度和頻率)的聲波信號，然后利用逆壓電效應(yīng)通過接收換能器把聲波重新轉(zhuǎn)換為電信號。當(dāng) SAW 器件暴露在某種環(huán)境下，由于聲波的傳播受到環(huán)境因素 (如濕度、溫度、壓力、質(zhì)量、粘度等)的影響，導(dǎo)致聲波的波速(頻率或相位)發(fā)生了變化。 或者說在某種程度上改變了聲波的傳播路徑(相位)，最終體現(xiàn)在接收到的信號和輸入的信號之間的差異上，這就是聲表面波傳感器的最基本的工作原理。聲表面波器件主要是通過在壓電晶體基片上制作插指電極(IDT )來實現(xiàn)聲電信號之間的轉(zhuǎn)換。1979 年，Wohltjen 和 Dessy[69]發(fā)表了 1 篇將 SAW 器件用作氣體傳感器的論文，他們提出采用 ST 切石英或 LiNbO3 的聲表面波（SAW）器件來檢測氣相色譜。此后，有關(guān) SAW 氣體傳感器的研制工作逐漸興起，可檢測氣體的種類也越來越多 [7075]。目前美國國家環(huán)境保護組織己經(jīng)把 SAW 氣體傳感器作為環(huán)境監(jiān)測的手段之一, 己經(jīng)產(chǎn)品化的 SAW 化學(xué)傳感器包括濕度傳感器 [7677]、和液體傳感器 [7879]。另外， W. Welsch 等 [80]在 1997 年就己經(jīng)成功把聲表面波傳感器應(yīng)用到免疫檢測中去，傳感器工作頻率為 345MHz,檢測血清中免疫球蛋白（IgG ）的濃度，靈敏度為 (ng mm2)，檢測限為 35pg。目前，聲表面波生物傳感器的研電子科技大學(xué)博士學(xué)位論文6究還處在初級階段，由于它所表現(xiàn)出來的其它傳感器所不能具有的高靈敏度，在今后一段時期一定會有較快的發(fā)展。 本論文選題的目的與意義根據(jù)上面的所綜述的四種生化傳感器的現(xiàn)狀與發(fā)展趨勢，結(jié)合本實驗室的實驗條件和前面課題所積淀的經(jīng)驗以及研究項目 “電子聚合物酶電極生物傳感器的研究” 的要求。本論文圍繞著電子聚合物材料和電子聚合物生物敏感材料的制備與表征、電子聚合物膜和電子聚合物生物敏感膜的制備，選擇場效應(yīng)管器件和壓電晶體器件作為基礎(chǔ)器件。在這些器件的設(shè)計與制備、傳感器敏感特性的測試等方面作了一系列的研究，旨在通過選擇與制備先進的材料、設(shè)計與制作出新的器件以期得到高靈敏、高選擇、高穩(wěn)定的生化毒劑傳感器來滿足臨床診斷、工業(yè)生產(chǎn)、環(huán)境保護、軍事探測等方面的要求。本課題根據(jù)當(dāng)今愈來愈烈的生化恐怖事件的形勢，采用當(dāng)前處在前沿應(yīng)用研究領(lǐng)域的電子聚合物材料來制作具有生化敏感的膜和生化傳感器既符合當(dāng)前形勢的需要，又能對電子聚合物在傳感器應(yīng)用方面的研究作出一點貢獻。開展這一課題的研究不僅對新材料在理論方面的發(fā)現(xiàn)具有重要的科研價值，而且對保護人們特別是戰(zhàn)士的生命財產(chǎn)安全具有重要的社會價值。 論文的主要工作內(nèi)容 第一章 緒論 主要綜述了生化傳感器在場效應(yīng)管、壓電、光纖、聲表面波等方面的國內(nèi)外研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢。第二章 離子敏場效應(yīng)管和壓電晶體生化傳感器結(jié)構(gòu)和工作原理 描述了常用的離子敏場效應(yīng)管和壓電晶體微天平的結(jié)構(gòu)特點，并對它們用作傳感器的工作原理進行了總結(jié)。第三章 電子聚合物膜及電子聚合物固定化酶膜的制備與表征 通過對電子聚合物膜和電子聚合物固定化酶成膜條件的研究，找到了它們最佳的成膜條件如下：1. 制備導(dǎo)電聚合物膜的最佳聚合反應(yīng)條件為：單體與氧化劑的摩爾比 為 1：4， 反應(yīng)溫度 5 ℃。 反應(yīng)時間 35 min。第一章 緒論72. 采用導(dǎo)電聚合物 PEDOT 固定化的丁酰膽堿酯酶膜涂敷在 pH 復(fù)合電極的表面，通過對底物氯化乙酰膽堿水解情況的研究，發(fā)現(xiàn)這種方法制備的固定化酶膜每平方毫米含 U 的酶時具有最好的活性。第四章 電子聚合物固定化的膽堿氧化酶膜的制備及性能測試研究 通過比較化學(xué)聚合和電化學(xué)聚合法制備的導(dǎo)電聚合物固定化的PEDOT/Chox（膽堿氧化酶）酶膜，發(fā)現(xiàn)用電化學(xué)方法制備的 PEDOT/Chox 酶膜中的酶在其表面因擁有許多的亞胺基而具有更好的活性，表面上存在的這些功能基團大大的提高了膜的敏感特性；同時，由于酶的摻入使得導(dǎo)電聚合物 PEDOT 的鏈長增加而具有不同的特征紫外光譜，利用本方法制備的 PEDOT 膜的紫外光譜的特征峰位置在 286nm, 而摻酶的 PEDOT/Chox 膜的紫外光譜的特征峰位置在 293nm 紅移了 7nm。由于厚度的增加使得紫外光譜的吸光度大大增加而用在膽堿的檢測等方面，成功的檢測了三種膽堿飼料，其相對誤差都在 5%以內(nèi)。第五章 電子聚合物基酶場效應(yīng)管生物傳感器的性能研究 通過在自己設(shè)計的耗盡型 NMOS 管的柵區(qū)位置沉積電子聚合物 PEDOT 固定化的膽堿酯酶膜來檢測這種場效應(yīng)管對有機磷毒劑敵敵畏的響應(yīng)。得到其濃度響應(yīng)的線性范圍從 ?106mol/L 到 ?103mol/L，響應(yīng)時間在 25 秒左右。第六章 H＋ 離子敏的電荷流動型場效應(yīng)管傳感器的特性研究 設(shè)計和制作了一種新型的對 H+具有較大的敏感度的電荷流動型場效應(yīng)管。通過在柵極開槽部分電沉積導(dǎo)電聚合物 PEDOT 膜。發(fā)現(xiàn)不同濃度的 H+誘導(dǎo)生成的PEDOT 膜具有不同的結(jié)構(gòu)，使得膜中具有不同的 H+通道數(shù)。通過建立一個等效電路模型成功地解釋了這種電荷流動型場效應(yīng)管對 H＋ 所表現(xiàn)出的較高的靈敏度,并通過對兩個電容進行測試，驗證了它的高靈敏性。第七章 敵百蟲壓電晶體生物傳感器的制備與性能測試研究 采用自組裝法制備了一種新型的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）膜固定的丁酰膽堿酯酶（BuChE）的壓電晶體敵百蟲生物傳感器。發(fā)現(xiàn)當(dāng)敵百蟲的濃度在 ppm 的濃度范圍內(nèi)，BuChEPVP 膜壓電晶體生物傳感器的頻率變化與敵百蟲濃度有良好的線性關(guān)系。通過對 BuChEPVP 傳感器進行的樣品檢測和干擾實驗證明，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過 5%，比敵百蟲濃度高十幾倍的 CO、NO H 2S、SO 2等大氣中主要污染氣體對其幾乎沒有影響。第八章 電極形狀修飾的敵敵畏壓電晶體傳感器的制備與性能測試研究 設(shè)計了一種上下電極面積不一樣的壓電晶體傳感器，通過在其電極較小的一面涂敷導(dǎo)電性和非導(dǎo)電性的聚合物膜來檢測它們對敵敵畏氣氛的響應(yīng)情況。結(jié)果電子科技大學(xué)博士學(xué)位論文8表明電導(dǎo)率越高的聚合物 PEDOT 膜對敵敵畏越敏感。并從敵敵畏與 PEDOT 膜相互作用的關(guān)系方面進行了解釋。同時通過對等效電路的分析計算了導(dǎo)電性的聚合物與敵敵畏相互作用過程中其電容的變化情況。還對它的應(yīng)用等方面進行了研究。最后，對本課題所從事的電子聚合物固定化的酶電極生物傳感器的研究進行了總結(jié)；并對本課題以后階段更進一步的研究和應(yīng)用的前景進行了展望。第二章 離子敏場效應(yīng)管和壓電晶體生化傳感器的工作原理及制作9第二章 離子敏場效應(yīng)管和壓電晶體生化傳感器的工作原理及制作 生化傳感器的基本結(jié)構(gòu)如圖 21 所示，它是利用酶(酵素)或其它敏感材料作為生化傳感器的敏感構(gòu)件，把產(chǎn)生的各種生化反應(yīng)通過適當(dāng)?shù)膿Q能器轉(zhuǎn)化為可以檢測的電信號、光信號、聲信號的一種裝置或系統(tǒng)。要了解這類傳感器除了要了解其特殊器件的特殊的工作原理之外，對其基礎(chǔ)的原理部分更應(yīng)該首先掌握。所以，本章主要闡述離子敏和壓電晶體生化傳感器的最基本的工作原理。圖 21 生物傳感器的基本構(gòu)成 生物傳感器的生物反應(yīng)基礎(chǔ)構(gòu)成生物傳感器的生物活性材料有酶、抗體、微生物、組織等等。但是由于抗體、微生物、組織等生物活性材料在制作的成本、工藝過程的難易、活性成分的流失性等方面存在的種種問題，相對來說，酶在生物傳感器中的應(yīng)用無論是從廣度還是從深度上都是生物活性材料中關(guān)注最多者之一。因而本研究中所用的生物活性材料除特殊說明外，都是指酶。 酶分子的構(gòu)成絕大多數(shù)的酶都是蛋白質(zhì)，與其它蛋白質(zhì)相同，酶分子也是由 20 種氨基酸組成。有些酶只有一條肽鏈，有些酶則有兩條肽鏈，還有些酶是由三條肽鏈組成。電子科技大學(xué)博士學(xué)位論文10幾乎所有的酶分子中都含有－NH 3+, COOH, SH, OH 等功能基團 [8183]。但并不是所有這些功能基團都與酶的活性有關(guān)，只有某些特定的功能基團才與催化作用直接相關(guān)，這種與酶的催化作用直接相關(guān)的化學(xué)基團叫做酶的必需基團。酶的特定的必需基團不僅有特定的組成而且還在空間具有一定的位置及相對取向。酶的活性部位可以認(rèn)為是由結(jié)合部位和催化部位所組成。結(jié)合部位負(fù)責(zé)與哪種底物相結(jié)合，因而它決定了酶的專一性 [8485]。催化部位負(fù)責(zé)酶的催化反應(yīng)，因而決定了酶的高效催化性 [8687]。酶的結(jié)合部位由于底物的種類和性質(zhì)不同所包含的氨基酸的種類和數(shù)目可以相差很大。在所有已知結(jié)構(gòu)的酶中，活性部位通常處于酶分子所含的裂縫或裂隙結(jié)構(gòu)中。裂縫或裂隙間的非極性結(jié)構(gòu)有利于酶與底物分子相結(jié)合，并排除水分子的進入。但是當(dāng)水分子本身也參與反應(yīng)時，裂縫中與會含有必要的極性基團?？傊阜肿又械牧芽p或裂隙構(gòu)成了特殊的對催化反應(yīng)來說非常必要的微環(huán)境 [8889]。 酶與底物結(jié)合的機理酶對它所催化的反應(yīng)以及在底物選擇上都具有高度的專一性。通常一種酶只能催化一個單一的化學(xué)反應(yīng)或一組密切相關(guān)的反應(yīng)。對酶和底物的這種特異性的結(jié)合機制曾經(jīng)提出過幾種不同的假說，如鎖鑰學(xué)說 [90]、誘導(dǎo)契合學(xué)說 [91]、過渡態(tài)中間物 [92]等。但是最常用的還是鎖鑰學(xué)說。它認(rèn)為整個酶分子的天然構(gòu)象是完整無缺的，且具有剛性。酶分子表面的特定部位具有一定的形狀，只有特定的化合物才能與之相契合。也就是說，酶與底