保護(hù)堿基添加總結(jié)-資料下載頁(yè)
2025-06-26 00:37本頁(yè)面
【正文】 。在標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)體系中，用2U Taq DNA聚合酶和800μmol/L dNTP（四種dNTP各200μmol/L）以質(zhì)粒（103拷貝）為模板，按95℃，25s；55℃，25s；72℃，1min的循環(huán)參數(shù)擴(kuò)增HIV1 gag基因區(qū)的條件下，引物3′端錯(cuò)配對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的影響是有一定規(guī)律的。A∶A錯(cuò)配使產(chǎn)量下降至1/20，A∶G和C∶C錯(cuò)七下降至1/100。引物A：模板G與引物G：模板A錯(cuò)配對(duì)PCR影響是等同的?！涠艘锏?′端限定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5′端修飾包括：加酶切位點(diǎn)；標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白質(zhì)結(jié)合DNA序列；引入突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和引入一啟動(dòng)子序列等。如擴(kuò)增編碼區(qū)域，引物3′端不要終止于密碼子的第3位，因密碼子的第3位易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率。特殊目的的引物設(shè)計(jì)將在有關(guān)章節(jié)討論。隨著人們對(duì)引物的認(rèn)識(shí)，一些引物的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)程序也應(yīng)運(yùn)而生，下面將討論有關(guān)引物計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)方法。 PCR參數(shù)設(shè)定的基本原則 PCR知識(shí) 一個(gè)PCR反應(yīng)開(kāi)始，首先是雙鏈DNA解離為單鏈，使之有利于與引物結(jié)合過(guò)程可以通過(guò)加熱來(lái)完成。在90—95℃條件下，即使復(fù)雜的DNA分子，如人基因組DNA也可變性成單鏈，根據(jù)模板DNA復(fù)雜程度，可以調(diào)整變性溫度和時(shí)間。一般情況下選擇94‘C、30s可使各種復(fù)雜DNA分子完全變性。過(guò)高溫度或持續(xù)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，對(duì)TaqDNA聚合酶活性和dNTP分子都會(huì)造成損害。變性后的DNA很快冷卻至40～60℃，即可使引物和模板DNA發(fā)生結(jié)合。這是由于模板DNA結(jié)構(gòu)比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間碰撞的機(jī)會(huì)大大高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞。復(fù)性溫度的選擇，可以根據(jù)引物的長(zhǎng)度和其G+C含量確定。引物長(zhǎng)度為15～25bp時(shí)，退火溫度可通過(guò)Tm＝4X(G+C)+2X (AdT)計(jì)算得到。在Tm允許的溫度范圍內(nèi)，選擇較高的退火溫度可大大減少引物和模板之間的非特異結(jié)合，提高PCR的特異性。退火時(shí)間設(shè)置為30s，足以使引物和模板之間完全結(jié)合。PCR反應(yīng)的延伸溫度為70—75℃，此時(shí)，TaqDNA聚合酶具有最高活性。引物在16個(gè)核苷酸以下時(shí)，過(guò)高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合?？刹捎梅磻?yīng)溫度緩慢升高到70～75℃的方法。因?yàn)樵谧畛踺^低溫度下，DNA聚合酶已催化延伸反應(yīng)開(kāi)始，隨后的較高溫度不會(huì)對(duì)“延長(zhǎng)”過(guò)的引物和DNA模板的結(jié)合發(fā)生影響。PCR延伸反應(yīng)的時(shí)間，可根據(jù)待擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度而定。一般lkb以內(nèi)的片段，延伸時(shí)間lmin足夠。擴(kuò)增片段在lkb以上則需增加延伸時(shí)間。以上參數(shù)確定后，PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。理論上20～25次循環(huán)后，PCR產(chǎn)物的積累即可達(dá)到最大值。實(shí)際操作中由于每步反應(yīng)的產(chǎn)率不可能達(dá)到完全，因此不管模板濃度多少，20～30次是比較合理的循環(huán)次數(shù)。循環(huán)反應(yīng)的次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量也會(huì)增
畢業(yè)設(shè)計(jì)相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1