【正文】 完畢，無菌雙蒸水洗， mol NaOH 中浸泡30 min，水洗；在堿性條件下（ mol NaOH）用毛細(xì)管轉(zhuǎn)印法將DNA片段轉(zhuǎn)移到帶正電荷的尼龍膜上。D、 DNA固定基因組DNA轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，將膜取出，用2SSC浸泡5 min；之后將膜取出置于濾紙上晾干，然后將濾紙對(duì)折，把膜包于其中，注意不要折損膜；將膜置于120 ℃烘烤箱中30 min，使DNA固定在膜上。E、 探針準(zhǔn)備用PstI酶切質(zhì)粒pMarB，100 181。L 體系（表24），37 ℃水浴4 h；%瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段， kb片段（轉(zhuǎn)座子TnYLB1）作為雜交探針，用適量TE溶解回收片段，電泳驗(yàn)證DNA片段濃度，確保雜交時(shí)探針終濃度為25 ng/mL?；厥辗椒ǜ鶕?jù)質(zhì)粒DNA純化回收試劑盒的說明書。地高辛標(biāo)記探針：取1 181。g kb DNA片段，加入無菌雙蒸水定容到16 181。L，沸水浴10 min，使DNA變性，之后迅速置于冰水混合物中冰??；待徹底冷卻后，取4 181。L地高辛與變性后的DNA片段混合，瞬時(shí)離心；之后置于37 ℃溫育16 h，使地高辛與DNA片段結(jié)合，制成雜交探針；65 ℃，處理10 min以終止反應(yīng)；將制備好的探針保存于20 ℃?zhèn)溆?。檢測(cè)探針效率：檢測(cè)所制備的探針濃度對(duì)取得理想的雜交效果至關(guān)重要，雜交液中探針濃度過高容易產(chǎn)生背景；而雜交液中探針濃度過低會(huì)導(dǎo)致顯色時(shí)條帶不清晰，甚至觀察不到條帶。探針效率檢測(cè)方法根據(jù)Southern雜交試劑盒DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit I的說明書。表24 Reaction conditions of PstI試劑體積（181。L）PstI5Buffer10DNA≤5181。g無菌雙蒸水up to 100注：酶切條件為37 ℃水浴過夜。 F、 雜交用無菌雙蒸水清洗雜交管，檢測(cè)雜交管是否漏水，檢測(cè)雜交爐的溫度是否穩(wěn)定；確定雜交儀器完好后，調(diào)節(jié)雜交爐溫度到37 ℃，準(zhǔn)備雜交；將NC膜卷成圓筒，注意吸附DNA的一面朝內(nèi)，裝入雜交管，讓膜在管內(nèi)自由伸展且沒有重疊部分；加入10 mL 5SSC浸潤膜，使膜貼在管壁且無氣泡，把管放入雜交爐內(nèi)，讓雜交爐緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)10 min；倒掉SSC，加入15 mL雜交液，37 ℃預(yù)雜交30 min；沸水浴處理探針5 min，之后迅速放入冰水混合物中冷凍5 min；取適量探針加入15 mL雜交液中混勻，使探針濃度為25 ng/mL；預(yù)雜交結(jié)束后，倒掉預(yù)雜交液，加入含有探針的雜交液，37 ℃雜交16 h。G、 雜交后洗膜:雜交后的洗膜條件根據(jù)所用探針不同而不同。本文采用以下操作：雜交結(jié)束后，將膜才從雜交管中取出，% SDS的2SSC溶液中，15~25 ℃，50 r/min洗25 min；%SSC溶液中，25 ℃，50 r/min洗30 min。H、 免疫檢測(cè)：根據(jù)Southern雜交試劑盒說明，現(xiàn)制封閉液、抗體液、顯色液；在洗膜結(jié)束后對(duì)膜的處理?xiàng)l件都為15~25 ℃，50 r/min，具體操作過程如下：洗滌緩沖液中洗5 min， 100 mL 封閉液中反應(yīng)30min，20 mL抗體液中反應(yīng)30min，100 mL洗滌緩沖液洗215 min，20 mL檢測(cè)緩沖液中5 min。在上述操作結(jié)束后，將膜置入適當(dāng)大小的容器中，將10 mL顯色液均勻倒在膜上，避光靜置，反應(yīng)16h后，加入TE緩沖液終止反應(yīng)，觀察結(jié)果。② PCRA、 實(shí)驗(yàn)組：以突變株基因組DNA分別為模板；B、 對(duì)照組：以野生菌株09基因組DNA為模板作為陰性對(duì)照；以質(zhì)粒pMarB為模板作為陽性對(duì)照；不加DNA模板為空白對(duì)照； C、 反應(yīng)條件：25181。L反應(yīng)體系（表25），94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min30 s，30個(gè)循環(huán)。D、 結(jié)果統(tǒng)計(jì)：%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物大小。表25 PCR反應(yīng)體系（25181。L） Reaction conditions of PCR試劑體積(181。L)Taq酶10PCR BufferdNTP Mixture2模板DNA引物1引物2無菌雙蒸水up to 253 結(jié)果與分析 生防芽孢桿菌09原生質(zhì)體電擊轉(zhuǎn)化 GM2163在電阻400 Ω，電容5 μF，電壓2. 0 KV電擊參數(shù)條件下， GM2163效率達(dá)到：106 CFU/μg DNA。從轉(zhuǎn)化子中隨機(jī)挑取12個(gè)轉(zhuǎn)化子抽提質(zhì)粒，用PstI酶切質(zhì)粒并進(jìn)行電泳驗(yàn)證；由電泳結(jié)果（圖31）可知，從12個(gè)轉(zhuǎn)化子中分別抽提的質(zhì)粒在酶切后均呈兩條電泳條帶，且大小均分別與對(duì)照組（PstI酶切質(zhì)粒pMarB）結(jié)果一致，即分別約為： kb， GM2163，這為后面的研究工作提供了大量的質(zhì)粒資源。 生防菌09生長曲線測(cè)定相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[62]，當(dāng)細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長期中期時(shí)，有利于原生質(zhì)體的形成。本文測(cè)試了生防芽孢桿菌09在37 ℃，200 r/min搖床培養(yǎng)條件下24 h內(nèi)的生長情況，并根據(jù)樣品OD570值，（圖32）。對(duì)09生長曲線進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌處于生長的對(duì)數(shù)期中期， h。根據(jù)上述分析結(jié)果，本文在制備09原生質(zhì)體時(shí)，采取如下細(xì)菌培養(yǎng)條件：LB平板劃線培養(yǎng)09，挑取單菌落于50 mL PAB液體培養(yǎng)基中，30 ℃，200 r/min培養(yǎng)過夜；按2%接種量，轉(zhuǎn)接過夜培養(yǎng)物于新鮮的50 mL PAB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/ h。 生防菌09原生質(zhì)體的制備以及電擊轉(zhuǎn)化（1） 生防菌09原生質(zhì)體的制備：生防菌09是一株蠟樣芽孢桿菌，細(xì)胞壁比較厚，一般的電擊轉(zhuǎn)化方法很難達(dá)到轉(zhuǎn)化目的。因此，本文選用原生質(zhì)體電擊轉(zhuǎn)化方法，制備09原生質(zhì)體，破壞其細(xì)胞壁，使質(zhì)粒DNA更易于通過電穿孔的方式進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，提高轉(zhuǎn)化效率。成功制備芽孢桿菌原生質(zhì)體并獲得理想的原生質(zhì)體形成率和再生率，關(guān)鍵在于選取最佳溶菌酶濃度和最適反應(yīng)溫度以及時(shí)間。不同的芽孢桿菌具有不同的生理特點(diǎn)，本文依據(jù)09的生長曲線，選取了易于形成原生質(zhì)體的對(duì)數(shù)生長期的菌體，并設(shè)置了不同的破解細(xì)胞壁反應(yīng)條件組合：A： mg/mL，42 ℃反應(yīng)45 min；B：溶菌酶終濃度2 mg/mL，40 ℃反應(yīng)45 min ；C：溶菌酶終濃度10 mg/mL，37 ℃反應(yīng)90 min；D：溶菌酶終濃度20 mg/mL，37 ℃反應(yīng)30 min。通過多次重復(fù)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)（圖33），組合A為最佳組合，與其它組合相比，在此組合下，原生質(zhì)體形成率最高，而且再生率也最高。（2） 09原生質(zhì)體電擊轉(zhuǎn)化：由于原生質(zhì)體沒有細(xì)胞壁的保護(hù)，在較高電壓下，容易被電流擊穿，反而達(dá)不到轉(zhuǎn)化目的，因此本文將電擊參數(shù)設(shè)置為：電阻400 Ω，電容5 181。F，并分別選用不同電壓條件： kv、 kv、 kv、 kv、 kv進(jìn)行轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，尋找適合的電壓條件。在經(jīng)過多次試驗(yàn)后，發(fā)現(xiàn)， kv電壓下，DM3再生培養(yǎng)基上才出現(xiàn)轉(zhuǎn)化子，并且通過挑取轉(zhuǎn)化子劃線LB雙抗平板（Kan 50 181。g/mL, Erm 10 181。g/mL）觀察菌落形態(tài)，以及芽孢染色和革蘭氏染色等鑒定方法，發(fā)現(xiàn)，所得轉(zhuǎn)化子在形態(tài)特征上跟野生菌株沒有區(qū)別，視為轉(zhuǎn)化成功。圖31 PstI酶切驗(yàn)證質(zhì)粒pMarB轉(zhuǎn)化GM2163結(jié)果 Result of enzyme digestion by PstI注：1: Marker。 2: 質(zhì)粒pMarB。 3: 轉(zhuǎn)化子1。 4: 轉(zhuǎn)化子2。 5: 轉(zhuǎn)化子3。 6: 轉(zhuǎn)化子4。 7: 轉(zhuǎn)化子5。 8: 轉(zhuǎn)化子6。 9: 轉(zhuǎn)化子7。 10: 轉(zhuǎn)化子8。 11: 轉(zhuǎn)化子9。 12: 轉(zhuǎn)化子10。 13: 轉(zhuǎn)化子11。 14:轉(zhuǎn)化子12。 15: 空白對(duì)照。用PstI對(duì)從12個(gè)GM2163轉(zhuǎn)化子中提取的質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證。采用20 181。L的酶切反應(yīng)體系，以不加DNA的反應(yīng)體系為空白對(duì)照，于37 ℃水浴4 h，% 瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)，從12個(gè)轉(zhuǎn)化子中分別抽提的質(zhì)粒在酶切后均呈兩條電泳條帶，且大小均分別與酶切質(zhì)粒pMarB結(jié)果一致，即分別約為： kb；另外，空白對(duì)照樣孔中無條帶顯示，證明反應(yīng)體系沒有被DNA污染，酶切結(jié)果可信。圖32 09生長曲線 Growth curve of 09注：37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)， h取樣150 181。L測(cè)OD570值，光滑曲線為擬合曲線，擬合曲線周圍的點(diǎn)代表實(shí)際測(cè)量值； h后，細(xì)菌處于生長的對(duì)數(shù)期中期。圖33 不同的破解細(xì)胞壁反應(yīng)條件下09原生質(zhì)體形成率和再生率 Results of 09 protoplast formation and regeneration under different conditions注：A： mg/mL，42 ℃反應(yīng)45 min；B：溶菌酶終濃度2 mg/mL，40 ℃反應(yīng)45 min；C：溶菌酶終濃度10 mg/mL，37 ℃反應(yīng)90 min；D：溶菌酶終濃度20 mg/mL，37 ℃反應(yīng)30 min；進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，數(shù)據(jù)取平均值，由公式（21）計(jì)算原生質(zhì)體形成率，由公式（22）計(jì)算原生質(zhì)體再生率。 誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座子TnYLB1轉(zhuǎn)座：為了探索轉(zhuǎn)座子TnYLB1的最佳轉(zhuǎn)座條件，根據(jù)質(zhì)粒pMarB上復(fù)制子repG+ts的溫敏特性，本文設(shè)置了5個(gè)不同誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座溫度：46 ℃、47 ℃、48 ℃、49 ℃、50 ℃，和4個(gè)不同處理時(shí)間：4 h、6 h、8 h、10 h，探索誘變溫度和處理時(shí)間的最佳組合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表31），將轉(zhuǎn)化子在46 ℃處理10 %，明顯高于其他處理?xiàng)l件所能達(dá)到的轉(zhuǎn)座效率。因此，在此轉(zhuǎn)座條件下，本文成功構(gòu)建了含有1125株突變株的突變體庫。表31 TnYLB1在不同轉(zhuǎn)座條件下轉(zhuǎn)座效率的比較 Results of tansposition under different conditions時(shí)間（h）轉(zhuǎn)座效率（%）46℃47℃48℃49℃50℃4(177。)(177。)(177。)(177。)(177。)6(177。)(177。)(177。)(177。)(177。)8(177。)(177。)(177。)(177。)–10(177。)(177。)–(177。)–注：在不同處理溫度和時(shí)間條件下誘導(dǎo)質(zhì)粒pMarB上的轉(zhuǎn)座子TnYLB1發(fā)生轉(zhuǎn)座，插入到09基因組上；由于質(zhì)粒pMarB的溫敏復(fù)制子repG+ts在轉(zhuǎn)座溫度條件下不能復(fù)制，因此在TnYLB1（攜帶Kanr）完成轉(zhuǎn)座后，除轉(zhuǎn)座子之外的質(zhì)粒骨架（攜帶Ermr）將不能繼續(xù)存在宿主菌中,而使宿主菌表現(xiàn)為對(duì)卡那霉素具有抗性，而對(duì)紅霉素敏感。挑取經(jīng)高溫處理后在LB(Kan 50 181。g/mL)平板上生長的單菌落，同時(shí)點(diǎn)種于Kan (50 181。g/mL) 平板和Erm（10 181。g/mL）平板相對(duì)應(yīng)的位置，30 ℃培養(yǎng)過夜；篩選具有卡那霉素抗性而對(duì)紅霉素敏感的突變株，由公式（23）計(jì)算轉(zhuǎn)座效率。表格中的轉(zhuǎn)座效率為三次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，“177?！贝順?biāo)準(zhǔn)偏差，“–”代表在該處理?xiàng)l件下，LB(Kan 50181。g/mL)平板上沒有菌落生長，轉(zhuǎn)座子TnYLB1沒有發(fā)生轉(zhuǎn)座，字體加粗?jǐn)?shù)據(jù)為最佳反應(yīng)條件以及相應(yīng)的結(jié)果。 突變體庫的評(píng)價(jià)：理想的轉(zhuǎn)座插入突變體庫，應(yīng)該是由轉(zhuǎn)座子隨機(jī)插入到野生菌株基因組上，獲得不同突變株共同組成的突變體庫。本文通過高溫誘導(dǎo)轉(zhuǎn)座子TnYLB1發(fā)生轉(zhuǎn)座，插入到生防菌09基因組上，獲得1125株轉(zhuǎn)座插入突變株。為驗(yàn)證轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)的隨機(jī)性，本文通過比較突變株與野生菌株09菌落形態(tài)特征，從突變體庫中篩選獲得202株菌落形態(tài)突變株；之后從202株突變株中選取菌落形態(tài)特征與野生菌株有明顯差異的5株突變株，編號(hào)分別為：53576062638，深入研究其與野生菌株表型特征的差異；并通過Southern雜交和PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)座子在野生菌株09基因組上的隨機(jī)插入，進(jìn)一步從分子生物學(xué)角度初步評(píng)價(jià)突變體庫。 表型評(píng)價(jià)：（1） 比較突變株與野生菌株09生物薄膜形成能力：① 比較突變株與野生型菌株09在玻璃試管上形成生物薄膜的能力：通過測(cè)定5株突變株與野生菌株09在玻璃管壁上形成生物薄膜的能力，發(fā)現(xiàn)（圖34），09野生菌株能在玻璃管壁形成比較致密的生物薄膜，而5株突變株生物薄膜形成能力均與野生菌株有不同層次的差別。其中，539形成生物薄膜的能力最差，609和629其次，638 和573與其它3株突變株相比有較強(qiáng)的生物薄膜形成能力，但是所形成的生物薄膜不如野生菌株形成的生物薄膜致密。 圖34 野生菌株09與5株突變株在玻璃管壁上生物薄膜形成能力的比較； Comparing the ability of forming biofilms on glass tube between mutants and the wild type09注：①代表野生菌株09，②代表573突變株，③代表638突變株，④代表609突變株，⑤代表629突變株，⑥代表539突變株；菌株于30 ℃液體培養(yǎng)基BGM中活化后，按2%接種量于新鮮BGM中30 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)至生長對(duì)數(shù)期中期；用新鮮BGM稀釋菌液至OD570=；取2 ml稀釋菌液于玻璃試管（ cm）中，22 ℃靜置培養(yǎng)5 d，觀察細(xì)菌在玻璃管壁形成薄膜的情況；每個(gè)菌株做10個(gè)平行重復(fù)；實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；結(jié)果發(fā)現(xiàn)09野生菌株能在玻璃管壁形成比較致密的生物薄膜，而5株突變株生物薄膜形成能力均與野生菌株有不同層次的差別。② 96孔板法比較突變株與野生型菌株09生物薄膜形成能力：用結(jié)晶紫染色后，肉眼觀察附著在微孔壁上的生物薄膜發(fā)現(xiàn)（圖35），野生菌株09能形成大量的生物薄膜并緊密附著在微孔板壁上，顯示其較強(qiáng)的生物薄膜形成能力；5株突變株在微孔壁上形成生物薄膜的量均比野生菌株少，且生物薄膜形成能力從大到小依次為