16srdna實(shí)驗(yàn)原理-資料下載頁(yè)
2025-06-25 05:12本頁(yè)面
【正文】 ，37 ℃培養(yǎng)40 min。(6)取適量上述培養(yǎng)液均勻涂布在Amp/XGal/IPTG的LB平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。5. 轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定（1）重組菌株的菌落PCR通過藍(lán)白斑篩選陽性轉(zhuǎn)化子，用滅菌的槍頭將白色菌落接種至4 mL LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min，37 ℃培養(yǎng)4 h。取菌液作為PCR模板。PCR反應(yīng)體系（20 μL）： μL，10PCR buffer（含15 mmol/L MgCl2）2 μL，10 mmol/L dNTP μL， μmol/L的上游和下游引物各4 μL，菌液2 μL，5 U/μL Taq μL。PCR反應(yīng)條件：93 ℃預(yù)變性5 min、94 ℃變性18 s、56 ℃退火15 s、72 ℃延伸78 s，循環(huán)30次，72 ℃延伸7 min。%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。（2）重組質(zhì)粒的核苷酸序列的測(cè)定對(duì)經(jīng)過鑒定含有目的片斷的單克隆菌液加入甘油40 ℃保存，同時(shí)將同一單克隆菌液送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，將測(cè)得的序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)測(cè)序結(jié)果，用BLAST搜索軟件在NCBI（）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中調(diào)出相似性較高的16S rDNA基因序列，用ClustalX ，用Phylipwx軟件包中的Seqboot，Dnapars和Consense進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果提交鑒定菌株的序列與哪個(gè)種最匹配，并構(gòu)建該菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹。4
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