【正文】 脂凝固后，翻轉平板，置36177。1℃溫箱內培養(yǎng)48177。2h，取出計算平板內菌落數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，即得每克（每毫升）樣品所含菌落總數(shù)。 　　2．傾注用培養(yǎng)基應在46℃水浴內保溫，溫度過高會影響細菌生長，過低瓊脂易于凝因而不能與菌液充分混勻。如無水浴，應以皮膚感受較熱而不燙為宜。 　　傾注培養(yǎng)基的量規(guī)定不一，從12~20ml不等，一般以15ml較為適宜，平板過厚可影響觀察，太薄又易于干裂。傾注時，培基底部如有沉淀物，應將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計數(shù)觀察。 3．為使菌落能在平板上均勻分布，檢液加入平皿后，應盡快傾注培養(yǎng)基并旋轉混勻，可正反兩個方向旋轉，檢樣從開始稀釋到傾注最后一個平皿所用時間不宜超過20min，以防止細菌有所死亡或繁殖。 　　4．培養(yǎng)溫度一般為37℃（水產品的培養(yǎng)溫度，由于其生活環(huán)境水溫較低，故多采用30℃）。培養(yǎng)時間一般為48h，有些方法只要求24h的培養(yǎng)即可計數(shù)。培養(yǎng)箱應保持一定的濕度，瓊脂平板培養(yǎng)48h后，培養(yǎng)基失重不應超過15％。 　　5．為了避免食品中的微小顆?；蚺嗷械碾s質與細菌菌落發(fā)生混淆，不易分辨，可同時作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板，不經培養(yǎng)，而于4℃環(huán)境中放置，以便計數(shù)時作對照觀察。 　　在某些場合，為了防止食品顆粒與菌落混淆不清，可在營養(yǎng)瓊脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培養(yǎng)后菌落呈紅色，易于分別。 （三）計數(shù)和報告 　　1．操作方法：培養(yǎng)到時間后，計數(shù)每個平板上的菌落數(shù)?？捎萌庋塾^察，必要時用放大鏡檢查，以防遺漏。在記下各平板的菌落總數(shù)后，求出同稀釋度的各平板平均菌落數(shù)，計算處原始樣品中每克（或每ml）中的菌落數(shù)，進行報告。 　　2．到達規(guī)定培養(yǎng)時間，應立即計數(shù)。如果不能立即計數(shù)，應將平板放置于0－4℃，但不得超過24h。 　　3．計數(shù)時應選取菌落數(shù)在30~300之間的平板（SN標準要求為25~250個菌落），若有二個稀釋度均在30~300之間時，按國家標準方法要求應以二者比值決定，比值小于或等于2取平均數(shù)，比值大于2則其較小數(shù)字（有的規(guī)定不考慮其比值大小，均以平均數(shù)報告）。 　　4．若所有稀釋度均不在計數(shù)區(qū)間。如均大于300，則取最高稀釋度的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。如均小于30，則以最低稀釋度的平均菌落數(shù)乘稀釋倍數(shù)報告之。如菌落數(shù)有的大于300，有的又小于30，但均不在30~300之間，則應以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。如所有稀釋度均無菌落生長，則應按小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報告之。有的規(guī)定對上述幾種情況計算出的菌落數(shù)按估算值報告。 5．不同稀釋度的菌落數(shù)應與稀釋倍數(shù)成反比（同一稀釋度的二個平板的菌落數(shù)應基本接近），即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，則應視為檢驗中的差錯（有的食品有時可能出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，如酸性飲料等），不應作為檢樣計數(shù)報告的依據(jù)。 6．當平板上有鏈狀菌落生長時，如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，則應作為一個菌落計，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應按一個菌落計算，不要把鏈上生長的每一個菌落分開計數(shù)。如有片狀菌落生長，該平板一般不宜采用，如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)。 7．當計數(shù)平板內的菌落數(shù)過多（即所有稀釋度均大于300時），但分布很均勻，可取平板的一半或1/4計數(shù)。再乘以相應稀釋倍數(shù)作為該平板的菌落數(shù)。 8．菌落數(shù)的報告，按國家標準方法規(guī)定菌落數(shù)在1~100時，按實有數(shù)字報告，如大于100時，則報告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計算。固體檢樣以克（g)為單位報告，液體檢樣以毫升（ml）為單位報告，表面涂擦則以平方厘米（cm2）報告。（二）大腸菌群n 大腸菌群并非細菌學分類命名，而是衛(wèi)生細菌領域的用語，它不代表某一個或某一屬細菌，而指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，這些細菌在生化及血清學方面并非完全一致，其定義為：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產酸產氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。一般認為該菌群細菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。 n 大腸菌群分布較廣，在溫血動物糞便和自然界廣泛存在。調查研究表明，大腸菌群細菌多存在于溫血動物糞便、人類經?；顒拥膱鏊约坝屑S便污染的地方，人、畜糞便對外界環(huán)境的污染是大腸菌群在自然界存在的主要原因。糞便中多以典型大腸桿菌為主，而外界環(huán)境中則以大腸菌群其他型別較多。n 大腸菌群是作為糞便污染指標菌提出來的，主要是以該菌群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染。大腸菌群數(shù)的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。糞便是人類腸道排泄物，其中有健康人糞便，也有腸道患者或帶菌者的糞便，所以糞便內除一般正常細菌外，同時也會有一些腸道致病菌存在（如沙門氏菌、志賀氏菌等），因而食品中有糞便污染，則可以推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食物中毒和流行病的威脅，必須看作對人體健康具有潛在的危險性。 n 　　大腸菌群是評價食品衛(wèi)生質量的重要指標之一，目前已被國內外廣泛應用于食品衛(wèi)生工作中。大腸菌群檢驗方法：　　由于大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，即：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產酸產氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。因此大腸菌群的檢測一般都是按照它的定義進行。 　 國家標準采用三步法，即：乳糖發(fā)酵試驗、分離培養(yǎng)和證實試驗?！　∪樘前l(fā)酵試驗：樣品稀釋后，選擇三個稀釋度，每個稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。36177。1℃培養(yǎng)48177。2h，觀察是否產氣。 　　分離培養(yǎng)：將產氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉種于伊紅美藍瓊脂平板上，36177。1℃培養(yǎng)1824h，觀察菌落形態(tài)。 　　證實試驗：挑取平板上的可疑菌落，進行革蘭氏染色觀察。同時接種乳糖發(fā)酵管36177。1℃培養(yǎng)24177。2h，觀察產氣情況。 　　報告：根據(jù)證實為大腸桿菌陽性的管數(shù)，查MPN表，報告每100ml（g）大腸菌群的MPN值。 　　 《中華人民共和國國家標準 食品衛(wèi)生微生物學檢驗 大腸菌群測定》三、說明：1．MPN檢索表：　　MPN 為最大可能數(shù)(Most Probable Number)的簡稱。這種方法，對樣品進行連續(xù)系列進行稀釋，加入培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，從規(guī)定的反應呈陽性管數(shù)的出現(xiàn)率，用概率論來推算樣品中菌數(shù)最近似的數(shù)值。 　　MPN檢索表只給了三個稀釋度，如改用不同的稀釋度，則表內數(shù)字應相應降低或增加10倍。注意國家標準和行業(yè)標準中所附MPN表所用稀釋度是不同的，而且結果報告單位也不相同。 2．初發(fā)酵和證實試驗：　　無論是國家標準的三步法還是行業(yè)標準的兩步法，都利用了乳糖發(fā)酵管進行了兩次發(fā)酵試驗，培養(yǎng)基的配制略有不同，但都是為了證實培養(yǎng)物是否符合大腸菌群的定義，即“在37℃分解乳糖產酸產氣”。 　　初發(fā)酵陽性管，不能肯定就是大腸菌群細菌，經過證實試驗后，有時可能成為陰性。有數(shù)據(jù)表明，食品中大腸菌群檢驗步驟的符合率，初發(fā)酵與證實試驗相差較大。因此，在實際檢測工作中，證實試驗是必需的。 3．產氣量與倒管：　　在乳糖發(fā)酵試驗工作中，經?？梢钥吹皆诎l(fā)酵倒管內極微少的氣泡（有時比小米粒還小），有時可以遇到在初發(fā)酵時產酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡。實驗表明，大腸菌群的產氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產生比小米粒還小的氣泡。如果對產酸但未產氣的乳糖發(fā)酵如有疑問時，可以用手輕輕打動試管，如有氣泡沿管壁上浮，即應考慮可能有氣體產生，而應作進一步試驗。4．挑選菌落：國家標準中，需要對初發(fā)酵陽性培養(yǎng)物接種伊紅美藍平板分離，對典型和可疑菌落進行觀察和證實試驗。由于大腸菌群是一群細菌的總稱，在平板大腸菌群菌落的色澤、形態(tài)等方面較大腸菌更為復雜和多樣，而且與大腸菌群的檢出率密切相關。國家標準方法規(guī)定伊紅美藍平板為分離培養(yǎng)基，在該平板上，大腸菌群菌落呈黑紫色有光澤或無光澤時，檢出率最高；紅色、粉紅色菌落檢出率較低。 　另外，挑取菌落數(shù)與大腸菌群的檢出率有密切關系，只挑取一個菌落，由于機率問題，尤其當菌落不典型時，很難避免假陰性的出現(xiàn)。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如無典型菌落則應多挑幾個，以免出現(xiàn)假陰性。 5．抑菌劑：大腸菌群檢驗中常用的抑菌劑有膽鹽、十二烷基硫酸鈉、洗衣粉、煌綠、龍膽紫、孔雀綠等。抑菌劑的主要作用是抑制其它雜菌，特別是革蘭氏陽性菌的生長。 　 國家標準中乳糖膽鹽發(fā)酵管利用膽鹽作為抑菌劑，行業(yè)標準中LST肉湯利用十二烷基硫酸鈉作為抑菌劑，BGLB肉湯利用煌綠和膽鹽作為抑菌劑。 　 抑菌劑雖可抑制樣品中的一些雜菌，而有利于大腸菌群細菌的生長和挑選，但對大腸菌群中的某些菌株有時也產生一些抑制作用。有些抑菌劑用量甚微，稱量時稍有誤差，即可對抑菌作用產生影響，因此抑菌劑的添加應嚴格按照標準方法進行。 14