【正文】 測中應(yīng)用最廣泛的有： 1. ELISA(enzyme linked immunosorbent assay) ? 優(yōu)點： 具免疫熒光法和放射免疫法的反應(yīng)靈敏、特異性強的優(yōu)點、克服常規(guī)血清學方法中受病毒濃度、粒子形態(tài)和抗血清用量等缺陷。 ? 方法： 間接法、雙抗體法、雙夾心法、競爭法 ? 應(yīng)用： ELISA反應(yīng)快速便利，適合于大規(guī)模田間樣本的常規(guī)病毒檢測，也廣泛用于脫毒植物、無性繁殖的苗木以及種子上的病毒檢測。 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ ELISA） ?間接法 ?雙抗體夾心法 ?競爭法 ?直接法 ?雙夾心法 ?非標記抗體酶法 原 理 ： 酶標抗體 抗原 酶標抗原抗體復(fù)合物 底物 產(chǎn)物 顯色劑 比色測定 酶促反應(yīng) 將酶標記的抗原或抗體吸附到適當?shù)妮d體上進行抗原 — 抗體反應(yīng)及酶催化反應(yīng)。 免疫學方法 在病毒檢測中應(yīng)用最廣泛的有： 2. 免疫擴散 （單向與雙向） – 用于比較同源、異源抗原，可區(qū)別病毒不同種和不同株系。 3. 斑點免疫結(jié)合測定法（ DIBA） – 以硝酸纖維薄膜為載體進行酶聯(lián)免疫吸附測定。 – 硝酸纖維膜比酶聯(lián)板便宜而且攜帶方便，進行田間病害診斷時，可直接用病毒粗汁液進行大量樣本的測定。 – 比 ELISA簡單，實驗流程短，不需任何特殊設(shè)備，而且靈敏度高。 抗原 /抗體 吸附在 NC膜上，通過與相應(yīng)的 抗體 /抗原 和酶標記物反應(yīng)形成酶標記的 抗原 抗體復(fù)合物 ，加入相應(yīng)底物后顯色，呈現(xiàn)肉眼可見的顏色斑點，根據(jù)顏色有無和深淺判定。 免疫學方法 免疫擴散 – 用于比較同源、異源抗原，可區(qū)別病毒不同種和不同株系 有共同抗原，但不完全相同 不同抗原 免疫學方法 在病毒檢測中應(yīng)用最廣泛的有： ? 在 ELISA的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的植物病毒檢測技術(shù) ? 保持 ELISA對病毒檢測的靈敏度高、特異性強的特點，而且大大地簡化了操作程序，對病毒的檢測更加 快速、簡單、方便 。 ? 印跡在硝酸纖維膜上的樣品能 保存 3個月以上，檢測結(jié)果能 直觀 地顯示出病毒感染的部位。 ? 尤其適用于植物病毒的 大規(guī)模 普查，是近年來國外對植物病毒檢測廣泛采用的技術(shù)。 植物病毒的檢測 —— 組織印跡法 基本原理 與間接 ELISA相同，首先將待測樣品印跡在固相載體 —— NC上，用病毒的家兔特異性抗體 (Ig)與吸附在固相載體上的病毒進行特異性反應(yīng)，再與堿式磷酸酶(Alkaline phosphatase AP)標記的第二抗體（羊抗兔Fc）進行反應(yīng)，最后用堿式磷酸酶的反應(yīng)底物BCIP/NBT(5bromo4chloro3indolyl phosphate/ nitro blue tetrazolium)進行顯色反應(yīng)，根據(jù)顏色的變化，確定病毒的感染程度。 植物病毒的檢測 —— 組織印跡法 具體反應(yīng)： 堿式磷酸酶（ AP）以硝基酚磷酸鹽 為底物，在 不溶性藍色。 (辣根過氧化物酶 HRP是以H2O2為底物 ,需要供氫體如四甲基聯(lián)苯胺 (TMB)參與，在 可溶性黃色產(chǎn)物 ，需借助比色分析 .) 植物病毒的檢測 —— 組織印跡法 植物病毒的檢測 —— 組織印跡法 基本步驟 采樣 封閉 點樣 洗滌 病毒與特異抗體反應(yīng) 洗滌 第二抗體連接反應(yīng) 洗滌 顯色反應(yīng) 終止顯色 1干燥保存 采取植物葉、莖根等，避免手與樣品傷口接觸，裝入塑料袋。 將 NC膜 置于平整潔凈濾紙上，用手術(shù)刀片橫切樣品，將切口均勻壓印在膜上，印跡清晰為宜，每張膜上可排列數(shù)百個樣品，設(shè)正負對照。 將點好樣的膜置于盛有 2％脫脂奶粉的 PBS封閉液的培養(yǎng)皿中，封閉液的用量以覆蓋膜為宜．在 37℃ 下溫浴 lh或 4 ℃ 過夜 用 PBSTbuffer洗膜 3次， 5min/次 將清洗后的膜轉(zhuǎn)入含有特異性抗體的封閉液或 PBS緩沖液的培養(yǎng)皿中， 37℃ 下溫育 3h或 4℃ 過夜 7 洗畢，將膜轉(zhuǎn)入含堿式磷酸酶標記的羊抗兔第二抗體的 PBS緩沖液中， 37℃ 下溫育 3h或 4℃ 過夜 9 將 NC膜 轉(zhuǎn)入顯色液中直至陽性對照顯色為止（ 5~10min） 10 待陽性對照顯示清晰的紫藍色時，將膜轉(zhuǎn)入蒸餾水中．終止反應(yīng) 終止反應(yīng)后．將膜放置于干凈的衛(wèi)生紙之間，使之干燥，待完全干燥后過塑，便永久保存和觀察 植物病毒的檢測 —— 組織印跡法的靈敏度 ? 一次切割，連印 45次（蕙蘭花葉病毒） ? 感病葉汁液稀釋 1： 100 000，均呈 + ? 靈敏度可達 20pg/ml (1pg=1 1012g) ? 較 ELISA方法靈敏 2～ 3個反應(yīng)級 免疫學方法受到的限制 ① 檢測病毒的基礎(chǔ)是利用 病毒外殼蛋白的抗原性 ,但有些植物病毒在某些情況下缺乏外殼蛋白 ,而類病毒則沒有外殼蛋白 。 ② 季節(jié)性的不確定變化 問題常阻礙 +與 樣品的區(qū)分 :如 ELISA可以檢測出藜屬的葉、花、果實中的 CMLV,但對于休眠植物的木本部分卻難以成功 。 ③ 病毒在感染植株上 不均勻分布 ，病毒分離物的多樣性也給ELISA法帶來了問題，從蘋果、櫻桃、梨上分別取樣檢測ACLSV的存在，只有花瓣是可行的，因此準確鑒定局限于每個生長期的 2周時間 。 ④ CMLV與 PMV可以侵染相似的寄主，然而導致不同的病癥 ,并且兩者在 血清學上相關(guān) ，用 ELISA不易檢測。 病毒檢測的分子生物學技術(shù) 靈敏度高、特異性強 、 檢測速度更快 、 操作簡便 、 可用于大量樣品的檢測。 ? 可以從植物體的任何部分取樣檢測 ,很容易區(qū)分病毒，甚至病毒的不同株系或分離物。 ? 應(yīng)用組織印跡雜交技術(shù)檢測蕙蘭花葉病毒 (CyMV)和齒瓣蘭環(huán)斑病毒 (ORSV) ,其靈敏度可達 20pg/ml[1pg(皮克 )= 1 1012 g] ? 分子生物學檢測法是通過檢測病毒核酸來證實病毒的存在。此方法比血清學方法的靈敏度高 ,能檢測到 pg級甚至 fg級[1fg(飛克 )=1 1015g]的病毒 . 核酸序列分析技術(shù) dsRNA電泳技術(shù) PCR技術(shù) 限制性內(nèi)切圖譜 分子標記技術(shù) :AFLP、 RFLP、 RAPD 病毒檢測的分子生物學技術(shù) 病毒檢測的分子生物學技術(shù) 核酸分子雜交技術(shù) 雜交的雙方是使用的 探針 和 要檢測的核酸。 待測核酸 —— 克隆的基因片段、未克隆化的基因組 DNA、病毒總 RNA。 被檢測核酸 —— 提純 (膜上印跡雜交或液相雜交 ), 在細胞內(nèi)雜交(細胞原位雜交 )。所用探針必須標記 ,以便示蹤和檢測。 ? 最初用放射性同位素 (如 32Ｐ )標記探針 。但不利常規(guī)檢測 ,且探針壽命短。 ? 非放射性探針分子 ,如生物素或地高辛標記的探針分子 ? 特定基因標記 dsRNA電泳技術(shù) 原理 ： ssRNA病毒在植物體內(nèi)增殖，通過核酸互補而形成一種健康植物沒有的堿基配對 dsRNA。 dsRNA經(jīng) 提純、電泳、染色后 ,在凝膠上所顯示的譜帶可以反映每種病毒組群的特異性，并且有些單個病毒的 dsRNA在電泳圖譜上也顯示一定的特征。因此 ,利用病毒 dsRNA的電泳圖譜可以檢測出病毒的類型和種類。 已用于一些病毒屬的分類研究 (如黃化病毒屬、馬鈴薯Ｙ病毒屬、番石竹潛病毒屬、煙草壞死病毒屬、黃瓜花葉病毒屬、絨毛煙斑駁病毒屬 ) 。 病毒檢測的分子生物學技術(shù) dsRNA分析法在植物病毒的檢測中的用途 （ 1）判斷 RNA病毒是否存在； （ 2）在病毒屬水平上，對病毒進行鑒定； （ 3）鑒別單個病毒或株系； （ 4）檢測衛(wèi)星 RNA和衛(wèi)星病毒。 ? 很適合于病毒復(fù)合侵染的檢測： dsRNA分析法 是 非特異性 的實驗方法，可檢測樣本中的任何 dsRNA，包括數(shù)量少的病毒，以及除病毒侵染外其他來源的 dsRNA。 ? dsRNA分析法還可對來自田間的樣本直接檢測，如果是新病毒或不易純化的病毒， dsRNA分析則是病毒檢測的唯一選擇。 dsRNA分析法的局限性 （ 1）無法用于大數(shù)量樣本的檢測； （ 2）檢測需要知識和技能，尤其當無法與已知病毒相比較時； （ 3）病毒檢測時進行的 dsRNA分析，常包括潛隱病毒和非病毒的 dsRNA； （ 4） dsRNA不能用于 DNA病毒檢測。 多聚酶鏈式反應(yīng)技術(shù) (PCR) ? PCR用于植物病毒檢測：是先擴增植物病毒基因 DNA或RNA的 cDNA，再對擴增物 (DNA)進行電泳或核酸雜交分析。植物病毒 PCR擴增所用引物因病毒而異 ?對核酸序列已知病毒用 DNA合成儀 合成的引物 ， ?對核苷酸序列未知的病毒用 隨機引物 進行擴增， ?對大多數(shù) RNA植物病毒，先通過逆轉(zhuǎn)錄酶法 合成其 cDNA，后以 cDNA作為 PCR擴增的模板。 ? PCR技術(shù)發(fā)明后，不斷衍生出許多新的技術(shù)，使其應(yīng)用范圍不斷擴大，特異性和敏感性也不斷提高。 PCR用于植物病毒的鑒定與分類，靈敏度高、特異性強、快速簡便，特別當樣品病毒含量低，血清學方法難以檢出時，效果更好。 病毒檢測的分子生物學技術(shù) ? 植物病毒的癥狀特點 ? 植物病毒傳播 ? 病害防治原理與方法 ? 植物病毒抗病基因工程 ? 檢測原理與方法 本 章 要 點 病毒保藏