【正文】 hy) 由吸附層析發(fā)展起來的 ，是從復(fù)雜混和物中純化蛋白質(zhì)的最好方法。 又稱： 功能層析（ function chromatography） 生物專一吸附（ biospecific adsorption）選擇層析（ selective chromatography） 利用生物大分子間 特異的親和力 來純化生物大分子，如：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體；RNA和其互補(bǔ)的 DNA等。 ? 將待純化物質(zhì)的特異配體通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價(jià)的連接到載體上，待純化的物質(zhì)可被配體吸附，雜質(zhì)則不被吸附， 從層析柱流出， 變換洗脫條件，即可將 欲分離的物質(zhì)洗 脫下來 ，實(shí)現(xiàn)分離提純。 + C C C 配基 蛋白質(zhì) 固體載體 Affinity chromatography 2. 基質(zhì)的選擇 理想的基質(zhì)應(yīng)滿足以下要求： ① 高度的親水性。 ② 極低的非特異性吸附性（惰性）。 ③ 具有足夠的化學(xué)基團(tuán)。 ④ 適當(dāng)?shù)亩嗫仔浴? ⑤ 較好的理化穩(wěn)定性。 可被應(yīng)用的基質(zhì)（載體） ： （按性能優(yōu)劣排序） 瓊脂糖凝膠、聚丙稀酰胺凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素。 最常用的是瓊脂糖， Sepharose 1B到 10B 3. 配體的選擇 一對可逆結(jié)合的生物分子中與載體相偶聯(lián)的一方稱配體。 如抑制劑，底物，抗體，輔酶等。 優(yōu)良配體須具備的條件： 1）與待純化的物質(zhì)有較強(qiáng)的親和力。 2）具有與基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的基團(tuán)。 所要分離的目的產(chǎn)物 相應(yīng)的配基 酶 抗體 凝集素 激素 底物、抑制劑、輔酶（輔因子） 抗原、病毒、細(xì)胞 多糖、糖蛋白、細(xì)胞受體 受體、載體蛋白 目的產(chǎn)物與相應(yīng)的配基 4. 偶聯(lián)（親和吸附劑的制備） 配體一定，改造載體（基質(zhì)） 1）基質(zhì)活化： 不同的載體活化需要不同的活化劑。 常用：溴化氰（ CNBr）、環(huán)氧氯丙烷、1,4丁二醚、戊二醛、高碘酸鹽、苯醌等。 溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。 如用 CNBr 作用于葡聚糖和瓊脂糖的糖羥基 2）引入連接臂 （ space arm） 又稱手臂（ spacer ） “ 接臂 ” 的目的： 克服 影響配基與生物大分子的結(jié)合的 空間障礙 。 “ 接臂 ” 的途徑： 常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。 目前帶有各種手臂的系列載體已有商品供應(yīng)。如：AHSepharose 4B 常用手臂 5. 操作： 1） 層析前： 制備親和層析劑 選擇 根據(jù)欲分離物質(zhì)特性 配基 選擇 根據(jù)配基分子大小及基團(tuán)特性 載體 2）洗脫： 能削弱酶和親和吸附劑間的相互作用。 包括：非專一性洗脫和專一性洗脫 偶聯(lián) 親和層析劑 非專一性洗脫： 改變溫度 改變 pH值 改變離子強(qiáng)度 專一性洗脫： 競爭性洗脫劑（半抗原、抑制 劑、底物類似物） 被吸附物質(zhì)結(jié)合 競爭性地與 配體結(jié)合 6. 應(yīng)用 1）純化大分子物質(zhì) 如：純化糖蛋白用凝集素（能可逆性地結(jié)合碳水化合物的蛋白質(zhì)）， LectinSepharose 4B 2) 研究酶的結(jié)構(gòu)與功能： 分離有生物活性與失去生物活性的蛋白質(zhì)。 (六 ) 高效（壓）液相層析 （ HPLC： High Performance（ pressure） Liquid Chromatography ） ?特點(diǎn)： ①使用的固相支持劑顆粒很細(xì)，表面積很大 ,因而分辨率很高。 ②溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。 固定相（柱填料）： 常用 堅(jiān)硬、耐高壓 ， 粒度小 的硅膠。 顆粒大小對分辨率的影響 流速為 240ml/hr 流速對分辨率的影響 顆粒大小為 50－ 80目。 洗脫體積（ ml） 1. 基本原理 HPLC是利用樣品中的溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間分配系數(shù)的不同，進(jìn)行連續(xù)的無數(shù)次的交換和分配而達(dá)到分離的過程。 許多類型的柱層析都可用 HPLC來代替，如離子交換層析、吸附層析、凝膠過濾等。 2. 分類 按溶質(zhì)（樣品）在兩相分離過程的物理化學(xué)性質(zhì)分類： 親和色譜： —— 親和力 吸附色譜： —— 吸附力 離子交換色譜： —— 離子交換能力 凝膠色譜 ： —— 分子大小而引起的體積排阻 分配色譜： —— 分配系數(shù) 分配色譜又可分為： 正相色譜： 固定相為極性，流動(dòng)相為非極性。 反相色譜： 固定相為非極性，流動(dòng)相為極性。 用的最多，約占 60～ 70％。 固定相： 硅膠 填料是非極性的，官能團(tuán)為烷烴。 流動(dòng)相組成 ：常用 “ 甲醇 — H2O” 。 反相色譜中，蛋白質(zhì)按其疏水性大小進(jìn)行分離，極性越大疏水性越小的溶質(zhì)，越不易與非極性的固定相結(jié)合，先被洗脫下來。 即：隨著甲醇梯度的增加而洗脫出疏水性越來越強(qiáng)的蛋白質(zhì)。 3. 色譜儀組成 1）進(jìn)樣系統(tǒng) 2）輸液系統(tǒng) 3）分離系統(tǒng) 4）檢測系統(tǒng) 5）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) Principles of Operation for Chromatography Techniques Gel Filtration Ion Exchange Hydrophobic Interaction Affinity Reversed Phase 銜接層析技術(shù)時(shí)注意事項(xiàng) 層析技術(shù) 結(jié)束情況 起始條件 小量樣品 GF 低離子強(qiáng)度 IEX 高離子強(qiáng)度或 pH 改變 高離子強(qiáng)度 HIC 低離子強(qiáng)度 特異性結(jié)合 AC 特異性洗脫 樣品稀釋，緩沖液不變 第三節(jié) 電泳 ? 電泳 （ electrophoresis, EP） ： ? 指帶電粒子在電場中向著與其所帶電荷性質(zhì)相反的電極方向移動(dòng)的過程。 ? 電泳技術(shù) 是根據(jù)各種帶電粒子在電場中遷移速度的不同而對物質(zhì)進(jìn)行分離的實(shí)驗(yàn)技術(shù) 。 一、電泳的基本理論 1. 原理 : ? 在一定 pH條件下（用 buffer），不同大小、形狀及帶電顆粒在電場中的移動(dòng)速度不同（用遷移率表示），各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動(dòng)帶。 + 遷移率與 內(nèi)在特性 和 外界條件 有關(guān) 內(nèi)在特性 ：顆粒性質(zhì)（凈電荷量，顆粒大小、形狀） 外界條件 ：電場強(qiáng)度、溶液性質(zhì)、支持體特性 將帶凈電荷 Q的粒子放入電場，受到的電引力為： F引 =EQ 在溶液中 ,運(yùn)動(dòng)粒子與溶液之間存在阻力 F阻 F阻 = 6π rηV 當(dāng) F引 =F阻 時(shí) EQ = 6πrηV EQ V = 6πrη 影響遷移率的因素： 1）顆粒性質(zhì)： Q越大、 r 越小、形狀越接近球形， v 越快。 2）電場強(qiáng)度： E越高， v越快。 3）溶液性質(zhì)： ? pH值：離 pI越遠(yuǎn)， v越快。（用 buffer保持恒定） ? 離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度越高， v 越低。 原因：離子氛（ ionic atmosphere）。 通常，緩沖液離子強(qiáng)度在 。 4）電滲： 在電場中，液體對于固體支持物的相對移動(dòng)。 應(yīng)避免用高電滲物質(zhì)作支持介質(zhì)。 ? 自由界面電泳： 又稱移動(dòng)界面電泳 （ moving boundary electrophoresis, MBEP） ，指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進(jìn)行的電泳。 ? 區(qū)帶電泳 :（ zone electrophoresis, ZEP）指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。 支持介質(zhì)的作用 :防止電泳過程中的對流和擴(kuò)散。 2. 電泳的分類 ?按 支持介質(zhì)種類 的不同，區(qū)帶電泳可分為： ① 紙電泳 ： 用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。 ② 醋酸纖維素薄膜電泳 ：醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，優(yōu)點(diǎn)是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。 ?以上兩種類型的電泳，由于介質(zhì)的孔徑度大，沒有分子篩效應(yīng)，主要靠被分離物的電荷多少進(jìn)行分離。 ③ 瓊脂糖凝膠電泳 ： 一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。 ④聚丙烯酰胺凝膠電泳 ： 可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。分辨率較高。 ?聚丙烯酰胺 和 瓊脂糖 是目前實(shí)驗(yàn)室最常用的支持介質(zhì)。 3. 電泳常用設(shè)備 （ 1）電泳儀 ： 為電泳提供穩(wěn)定直流電源的裝置 。 常壓電泳儀 （ 600V） 高壓電泳儀 （ 3000V） 超高壓電泳儀 （ 30000V～ 50000V） （ 2）電泳槽： 自由界面電泳槽 管狀電泳槽 板狀電泳槽 （ 3） 附屬設(shè)備： 水平板式電泳槽 垂直板式電泳槽 二、聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳（ polyacrylamide gel electrophoresis， PAGE）是以 聚丙烯酰胺凝膠 作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。 聚丙烯酰胺凝膠是由 丙烯酰胺單體（ acrylamide，簡稱 Acr）和交聯(lián)劑 N， N’甲叉雙丙烯酰胺 （ methylane bisacrylamide，簡稱 Bis）在 催化劑 和 加速劑 作用下聚合的。 CH2=CH C=O NH2 CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH CH2CH[CH2CH]nCH2CH C=O C=O NH2 NH CH2 NH C=O CH2CH[CH2CH]nCH2CH C=O C=O NH NH2 丙烯酰胺 N,N’甲叉雙丙烯酰胺 聚丙烯酰胺 聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種： 1）化學(xué)催化系統(tǒng)： APTEMED 催化劑： 過硫酸銨 （ ammonium persulfate， AP） 加速劑： TEMED（ N， N， N’， N’四甲基乙二胺） 2）光催化系統(tǒng)：核黃素－光－（ TEMED） 催化劑 : 核黃素（維生素 B2） 引發(fā)劑 : 光 TEMED的存在，可加速聚合。 . 聚丙烯酰胺凝膠： 丙烯酰胺＋ N,N’－甲叉雙丙烯酰胺聚合而成 凝膠的機(jī)械強(qiáng)度、彈性和透明度粘著度取決于凝膠總濃度（ T） 和交聯(lián)度（ C）。 T= C= 凝膠濃度越大（?。讖皆叫。ù螅?，可分離分子量較?。ù螅┑念w粒 。 Acr與 Bis的重量比應(yīng)在 30左右。 凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關(guān)系 Acr（ g） +Bis（ g） V（ ml） X100% Acr（ g） +Bis（ g） Bis（ g） X100% 樣品 分子量（ Da） 適宜的凝膠濃度（％） 蛋白質(zhì)