new實(shí)驗(yàn)七gst酶親和層析及sds-page-資料下載頁
2025-05-25 22:58本頁面
【正文】 定要均勻，防止夾壞玻璃板 . ,用滴管快速加入 , 之后加少許蒸餾水封膠 ,靜臵 30－ 40分鐘 . ※ 配制凝膠要迅速 , 催化劑 TEMED要在注膠前再加入 ,否則凝膠無法注膠 .注膠過程最好一次性完成 ,避免凝膠不均勻 . ※ 封水的目的是為了使分離膠上沿平直，并隔絕空氣，促使凝膠聚合過程； ※ 凝膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面 . , 按比例配好濃縮膠 ,連續(xù)平穩(wěn)加入分離膠面上 ,迅速插入樣梳 ,靜臵 40分鐘 . ※ 樣梳需一次平穩(wěn)插入 ,梳口處不得有氣泡 ,梳底需水平 . Biochemistry Experiment 7 2022/6/22 38 ddH2O ml 30%凝膠貯液 ml 分離膠 buffer ml 10% SDS 100 μl 10% AP 100 μl 10%TEMED 100 μl ⑴ 配膠，先配分離膠，再陪濃縮膠。（在孵箱里或水浴鍋中聚合） ?10%分離膠配方：（ 10ml,一塊膠） 操作步驟 Biochemistry Experiment 7 2022/6/22 39 （ 2） %濃縮膠配方：（ 5ml） ddH2O ml 30%凝膠貯液 ml 濃縮膠 buffer ml 10%SDS 50 μl 10% AP 50 μl 10%TEMED 50 μl 操作步驟 Biochemistry Experiment 7 2022/6/22 40 。 插入電泳槽，倒入緩沖液體，用緩沖液沖洗樣品孔 ※ 要使鋸齒孔內(nèi)的氣泡全部排出 ,否則會(huì)影響加樣效果 . 6. 加樣前蛋白樣品濃度的測定（每個(gè)樣品孔內(nèi)可加入蛋白 20100μg)。 7. 上樣：在含有樣品的 Ep管中加入 10μl 的 2X SDSPAGE上樣 buffer混勻溶液，對(duì)照管中加入 10μl上樣 buffer，沸水浴煮 5min后方可上樣 (用微量注射器距槽底三分之一處進(jìn)樣 ,注射器不可過低 ,以防刺破膠體 ,)。 8. 電泳：接通電源， 先行 80V電泳 (濃縮膠 ) ，樣品進(jìn)入分離膠后改為 160V，溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約 5mm時(shí)，停止電泳。 9. 染色 取出凝膠，于考馬斯亮藍(lán) R250染色液中染色 30min。 ※ 剝膠時(shí)要小心 ,保持膠完好無損 . 10. 脫色 回收染色液，加入脫色液，脫至背景清晰。 . 操作步驟 Biochemistry Experiment 7 2022/6/22 41 思考題 ?比較血清蛋白的醋酸纖維薄膜電泳和 PAGE結(jié)果 ，試述為什么 PAGE具有較高的分辨率 ？ 回答三個(gè)效應(yīng)及如何形成 ？ ?在不連續(xù)體系 SDSPAGE中 ,當(dāng)分離膠加完后 ,需在其上加一層水 ,為什么 ? ?樣品溶解液中各種試劑的作用是什么 ? ?在不連續(xù)體系 SDSPAGE中 ,分離膠與濃縮膠中均含有 TEMED和 AP,試述其作用 ? Biochemistry Experiment 7 2022/6/22 42 注意事項(xiàng) ?丙烯酰胺具有中等毒性。常人每天允許的最大暴露量不超過 ，皮膚接觸可致中毒，癥狀為紅斑、脫皮、眩暈、動(dòng)作機(jī)能失調(diào)、四肢無力等。 ?丙烯酰胺是神經(jīng)毒劑，可以透過皮膚。 ?不要接觸皮膚，戴手套、口罩操作。 Biochemistry Experiment 7 2022/6/22 43 注意事項(xiàng) ? GluAragrose beads（谷胱甘肽 瓊脂糖珠）呈透明乳白色，顆粒較小，用 PBS洗珠子時(shí)要避免槍頭將珠子隨溶液一同吸出，造成樣品損失。 ? 沒有聚合的丙烯酰胺不要傾倒到水源附近 ? 一定要催化充分，使之完全聚合 ? 集中處理，實(shí)驗(yàn)中全部的膠由專門受過訓(xùn)練的人收集到一起，在一個(gè)特殊標(biāo)明的容器中保存，并進(jìn)一步催化使之反應(yīng)完全，最后送交學(xué)校危險(xiǎn)品倉庫，統(tǒng)一處理。 ? 聚丙烯酰胺通常認(rèn)為無毒，但是也要小心操作，因?yàn)槠渲锌赡芰粝律倭繘]有聚合的單體。 ? 保護(hù)實(shí)驗(yàn)儀器，不得損壞。
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