【正文】 0。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 179⑴ 新霉素抗性和胸苷激酶正負(fù)雙向選擇法① neor ：新霉素抗性基因，陽(yáng)性篩選標(biāo)志， neor基因插入用于打靶的外源 DNA中，當(dāng)重組后，細(xì)胞能在含新霉素（ G418)的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 180② HSVTK ：?jiǎn)渭儼捳畈《镜男叵汆奏ぜっ富?，陰性篩選標(biāo)志， 該基因產(chǎn)物可分解單核苷酸類似物而生成毒性產(chǎn)物，產(chǎn)生自殺效果。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 181HSVTK基因插入外源基因外側(cè)的載體序列中。同源重組時(shí)， TK基因通常丟失；隨機(jī)整合時(shí)， TK基因連同打靶載體整合到核基因組上，而同時(shí)獲得 neo和 HSVTK兩個(gè)基因的打靶細(xì)胞，此時(shí)加入更昔洛韋 （ GCV）可使細(xì)胞死亡。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 182neo/tk：無(wú)外源基因整合，細(xì)胞在G418中死亡；neo＋ /tk＋ ：隨機(jī)整合，在 GCV中死亡；neo＋ / tk：同源重組，在 G418和GCV中存活。用 G418正向選擇 neo，而用 GCV負(fù)向選擇 HSVtk第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 183Date 184普通 “正負(fù)篩選 ”置換型基因打靶載體同源序列（總長(zhǎng)度 58kb，斷臂不少于 2kb）HSVtkNeo被刪除的靶基因Date 185⑵ 正負(fù)雙向選擇法（用標(biāo)志基因作報(bào)告基因）基因打靶經(jīng)典實(shí)驗(yàn)常用次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（ hprt）基因（）作為基因打靶的靶基因。內(nèi)源性 hprt基因可作為正向和負(fù)向選擇的標(biāo)記基因。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 186hprt＋ 和 hprt－ 細(xì)胞可分別用 HAT（次黃嘌呤、氨甲蝶呤、胸腺嘧啶核苷培養(yǎng)基）或 6TG（ 6巰基鳥(niǎo)嘌呤）選擇培養(yǎng)基篩選出來(lái)。只有 hprt＋ 細(xì)胞能在 HAT培養(yǎng)基中生存，此為正向選擇只有 hprt－ 細(xì)胞能在 6TG培養(yǎng)基中生存，此為負(fù)向選擇第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 187? ⑶ 正向選擇法promoter ATG neor同源序列 1 同源序列 2同源序列 1 neor 同源序列 2同源序列 1 neor 同源序列 2以往的基因打靶載體正向選擇的打靶載體隨機(jī)插入： neo無(wú)啟動(dòng)子和起始密碼子，在 G418中死亡同源序列 1 同源序列 2promoter ATG targetgene同源序列 1 同源序列 2promoter ATG neor同源重組： neo有啟動(dòng)子和 ATG，在 G418中生存Date 188正向選擇打靶基因進(jìn)入細(xì)胞后的命運(yùn)① 無(wú)整合：目標(biāo)載體隨傳代丟失② 隨機(jī)整合：則 neor無(wú)啟動(dòng)子， neor表達(dá)受阻或因整個(gè)位點(diǎn)旁側(cè)基因啟動(dòng)子作用使neor表達(dá)。③ 同源重組：可借助自然存在的靶基因啟動(dòng)子和 AUG使 neor高表達(dá)用 G418篩選抗性細(xì)胞， Southern blot和PCR區(qū)分同源重組和隨機(jī)重組的細(xì)胞克隆， G418只需一次篩選。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 189如何獲得剔除小鼠 ?－胚胎工程Date 190簡(jiǎn)要過(guò)程129系Date 191將載體導(dǎo)入 ES細(xì)胞 選取發(fā)育第 45天的胚胎干細(xì)胞 (ES) 。 把外來(lái)基因轉(zhuǎn)入胚胎干細(xì)胞。 體外篩選打靶成功的細(xì)胞。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 1923 、將基因敲除 ES細(xì)胞注射入胚泡，形成嵌合胚胎4 、將 1020個(gè)胚泡植入假孕小鼠子宮。5 、獲得子代小鼠，篩選帶有靶基因的小鼠。常有的方法有： Southern印記、Northern印記雜合小鼠（ +/）間雜交，獲得子二代小鼠（ +/+、 /、 +/）。篩選的 /、 +/子二代小鼠。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 193Date 194基因打靶的策略第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型完全基因剔除（ plete knockout）大規(guī)模隨機(jī)基因剔除 — 基因捕獲(gene trapping)精細(xì)突變的引入時(shí)空上可調(diào)節(jié)的基因打靶染色體組大片段的刪除和重排基因敲入法研制轉(zhuǎn)基因小鼠Date 195完全基因剔除（ plete knockout）將陽(yáng)性選擇標(biāo)記基因插入到靶基因功能最關(guān)鍵的外顯子中，或通過(guò)同源重組篩除靶基因的 最重要功能域 。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 196大規(guī)模隨機(jī)基因剔除 — 基因捕獲(gene trapping)基因誘捕 (gene trap)是基于小鼠胚胎干細(xì)胞、報(bào)道載體 (誘捕載體 )建立的一種基因突變方法。誘捕載體在整合位點(diǎn)利用內(nèi)源基因調(diào)控元件模仿內(nèi)源基因表達(dá) , 使其表達(dá)終止 , 從而可以闡明內(nèi)源基因的功能。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 197此法利用某些能隨機(jī)插入基因序列的病毒，細(xì)菌或其他基因載體，在目標(biāo)細(xì)胞基因組中進(jìn)行隨機(jī)插入突變，建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的細(xì)胞庫(kù)，然后通過(guò)相應(yīng)的標(biāo)記進(jìn)行篩選獲得相應(yīng)的基因敲除細(xì)胞。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型根據(jù)細(xì)胞的不同，插入載體的選擇也有所不同。 逆轉(zhuǎn)錄病毒 可用于 動(dòng)植物細(xì)胞 的插入； 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的 TDNA轉(zhuǎn)化 和 轉(zhuǎn)座子 常用 植物細(xì)胞 ； 噬菌體 可用于 細(xì)菌 基因敲除。Date 198建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的 ES細(xì)胞庫(kù)通常 基因捕獲載體 是一個(gè)無(wú)啟動(dòng)子的報(bào)道基因，通常是 neo基因；neo 基因插入到 ES 細(xì)胞染色體組中，并利用捕獲基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件實(shí)現(xiàn)表達(dá)的 ES 克隆可以很容易地在含 G418 的選擇培養(yǎng)基中篩選出來(lái)。從理論上講，在選擇培養(yǎng)基中存活的克隆應(yīng)該 100％地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通過(guò)篩選標(biāo)記基因側(cè)翼 cDNA或染色體組序列分析來(lái)獲得。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 199基因誘捕載體的特點(diǎn) : ① 無(wú)啟動(dòng)子② 報(bào)道基因上游有一個(gè)剪接受體位點(diǎn)在內(nèi)源性基因的順式調(diào)控元件啟動(dòng)子、增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄活性作用下 ,通過(guò) mRNA 前體的剪接 , 上游編碼基因與報(bào)道基因產(chǎn)生融合轉(zhuǎn)錄 , 內(nèi)源性基因表達(dá)受阻 , 報(bào)道基因以內(nèi)源基因模式進(jìn)行表達(dá)。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 200Date 201Date 202由于誘捕載體及其報(bào)道基因的特點(diǎn) , 基因誘捕技術(shù)可用于高通量生產(chǎn) , 便于小鼠基因功能的大規(guī)模研究 , 為各類疾病動(dòng)物模型的建立奠定良好基礎(chǔ)。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 203利用基因捕獲可以建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的 ES 細(xì)胞庫(kù) , 節(jié)省大量篩選染色體組文庫(kù)以及構(gòu)建特異打靶載體的工作及費(fèi)用 , 更有效和更迅速地進(jìn)行小鼠染色體組的功能分析。用基因捕獲法在單次實(shí)驗(yàn)中可以獲得數(shù)以百計(jì)的帶有 單基因剔除的 ES克隆。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 204精細(xì)突變的引入插入法和置換法共同的缺點(diǎn)是靶位點(diǎn)上最終留下了有轉(zhuǎn)錄活性的外源標(biāo)記基因 , 這對(duì)于研究基因組中更加精細(xì)、復(fù)雜的改變十分不利 。 如對(duì)于點(diǎn)突變、堿基替換或啟動(dòng)子、增強(qiáng)子的研究來(lái)說(shuō) , 在染色體基因定點(diǎn)修飾的位置上 不留下異源輔助基因 是非常必要的第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 205精細(xì)突變的引入方法包括：① 標(biāo)記和置換法（ Tag and exchange）② 雙置換法 (Double Replacement)③ 一觸即脫 (hitandrun)法④ CreLoxP系統(tǒng)引入點(diǎn)突變 ① ② ③ 均需要兩次篩選或兩次打靶第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 206標(biāo)記和置換法 (Tag and Exchange) 該方法的特點(diǎn)是它是用兩個(gè)不同的置換型載體進(jìn)行兩次連續(xù)的基因重組完成。第一步的同源重組插入正負(fù)篩選標(biāo)記基因（如 neo和 tk）對(duì)靶基因進(jìn)行 “ 標(biāo)記 ” ；第二步用在同源序列上帶有精細(xì)突變的載體來(lái)轉(zhuǎn)染第一步得到的 ES克隆，帶有精細(xì)突變的同源序列將置換下被 “ 標(biāo)記 ” 的靶基因。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 207Date 208雙置換法 (Double Replacement) 第一步用含有 Hprt基因的重組載體轉(zhuǎn)染Hprt–ES細(xì)胞， Hprt基因的雙側(cè)是靶基因同源序列，通過(guò)培養(yǎng)基篩選發(fā)生同源重組、 Hprt 基因整合到基因組中的陽(yáng)性克隆。第二步，用攜帶突變同源序列的重組載體轉(zhuǎn)染已獲得的 Hprt+ES細(xì)胞。同源重組發(fā)生后，突變序列整合入基因組， Hprt 被置換出來(lái)。 Hprt–細(xì)胞可在 6GT培養(yǎng)基上篩選出來(lái)。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 209HPRTEScellDate 210打了就走策略 (Hit and Run ) 也稱進(jìn)退策略。利用一個(gè)基因載體進(jìn)行兩次同源重組第一步（ Hit）用插入型載體進(jìn)行同源重組，在靶位點(diǎn)插入帶有突變的基因組序列以及載體骨架，載體骨架上帶有兩個(gè)篩選標(biāo)記（如正篩選標(biāo)記基因 neo和負(fù)篩選標(biāo)記基因 tk）；第二步（ Run）利用 tk抗性篩選，富集發(fā)生了染色體內(nèi)重組的克隆。 染色體內(nèi)重組 去除了含有負(fù)篩選標(biāo)記基因的載體序列，由于負(fù)篩選標(biāo)記基因的消失，細(xì)胞就恢復(fù)了對(duì)負(fù)篩選藥物的抗性，因此，回復(fù)突變體可以在負(fù)選擇培養(yǎng)基中存活下來(lái)。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 211hitandrunDate 212最后通過(guò)分子生物學(xué)方法鑒定是否引入了突變Date 213CreLoxP重組酶系統(tǒng)在新型 基因打靶中獲得廣泛應(yīng)用，是 條件性基因打靶、 誘導(dǎo)性基因打靶 、時(shí)空特異性基因打靶策略的技術(shù)核心 。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Cre重組酶：于 1981年從 P1噬菌體 中發(fā)現(xiàn)，是一種位點(diǎn)特異性重組酶，能介導(dǎo)兩個(gè)LoxP位點(diǎn)（序列）之間的特異性重組，使LoxP位點(diǎn)間的基因序列被刪除或重組。Date 214LoxP（ locus of Xover P1）序列：來(lái)源于 P1噬菌體，是有兩個(gè) 13bp反向重復(fù)序列和中間間隔的 8bp序列共同組成， 8bp的間隔序列同時(shí)也確定了LoxP的方向。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 215應(yīng)用 CreLoxP系統(tǒng)將精細(xì)突變導(dǎo)入基因組的原理是：在置換型的打靶載體中，正負(fù)篩選標(biāo)記基因兩側(cè)各放置一個(gè) LoxP序列，并被置于靶基因的內(nèi)含子中；攜帶精細(xì)突變的外顯子位于載體一側(cè)的同源臂上。經(jīng)過(guò)同源重組和突變的鑒定后，通過(guò)轉(zhuǎn)染將 Cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入中靶 ES細(xì)胞。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 216Cre重組酶介導(dǎo)兩個(gè) LoxP位點(diǎn)間的重組是一個(gè)動(dòng)態(tài)、可逆的過(guò)程，可以分成三種情況： 　　如果兩個(gè) LoxP位點(diǎn)位于一條 DNA鏈上，且方向相同， Cre重組酶能有效切除兩個(gè) LoxP位點(diǎn)間的序列； 　　如果兩個(gè) LoxP位點(diǎn)位于一條 DNA鏈上，但方向相反， Cre重組酶能導(dǎo)致兩個(gè) LoxP位點(diǎn)間的序列倒位； 　　如果兩個(gè) LoxP位點(diǎn)分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上， Cre酶能介導(dǎo)兩條 DNA鏈的交換或染色體易位。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 217LoxP序列 Cre重組酶Date 218? CreLoxP系統(tǒng)誘導(dǎo)的基因敲除Date 219Cre/LoxP體系一次同源重組去除篩選標(biāo)記與 Cre+小鼠雜交Date 220Date 221Date 222① 無(wú)整合：目標(biāo)載體隨傳代丟失② 隨機(jī)整合：則 neor無(wú)啟動(dòng)子， neor表達(dá)受阻或因整個(gè)位點(diǎn)旁側(cè)基因啟動(dòng)子作用使 neor表達(dá)。③ 同源重組：可借助自然存在的靶基因啟動(dòng)子和 AUG使 neor高表達(dá)用 G418篩選抗性細(xì)胞， Southern blot和 PCR區(qū)分同源重組和隨機(jī)重組的細(xì)胞克隆， G418只需一次篩選。第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 223時(shí)空上可調(diào)節(jié)的基因打靶是在特定組織器官或特定細(xì)胞中進(jìn)行的基因打靶應(yīng)用 Cre/LoxP和 FLP/frt系統(tǒng)第三節(jié) 用基因打靶建立動(dòng)物模型Date 224promoter Cre啟 動(dòng) 子 表達(dá)的 組織CMV 各種 組織WAP 乳腺βLactoglobulin乳腺Albuminenhancer肝 臟αmyosinheavychain心 臟AminopeptidaseN骨髓Date 225Date 226Date 227? ㈤染色體組大片段的刪除和重排exon1 hprtΔ3 hprtΔ5 exon10Creexon9 hprtΔ5hygro exon10exon1 hprtΔ3 neo exon2 第一次打靶第二次打靶Date 228? ㈥基因敲入法研制轉(zhuǎn)基因小鼠CreCre酶誘導(dǎo)的重組Date 22