【正文】 帶有旋速器的控制器來選擇轉頭的轉速。除速度控制系統(tǒng)以外，還有一個過速保護系統(tǒng)，以防止轉速超過轉頭最大規(guī)定轉速時引起的轉頭撕裂或爆炸。為此目的，離心腔總是用能承受此種爆炸的裝甲鋼板密閉。 溫度控制：其溫度控制是由安置在轉頭下面的紅外線射量感受器直接而連續(xù)地監(jiān)測轉頭的溫度，以保證更準確更靈敏的溫度調控。真空系統(tǒng)：當轉速超過4000 r／min 時，空氣與旋轉的轉軸之間的摩擦生熱成為嚴重的問題。為了消除這種熱源．超速離心機一般增添了真空系統(tǒng)。將離心腔密封，并通過兩個串聯(lián)工作的真空泵系統(tǒng)抽成真空。第一個工作泵與一般實驗室的機械真空泵相同，它可抽真空到13．33~666Pa。一旦離心腔內的壓力減低到33．33Pa 以下，水冷擴散泵也開始工作。利用這兩個泵，可使真空度達到并維持在0．13~0．26Pa。在摩擦力降低的情況下，速度才有可能升高到所需的轉數(shù)。轉頭：制備性超速離心機采用的轉頭有各種各樣．一般可分為兩大類：角式轉頭和甩平式轉頭。角式轉頭的孔穴與旋轉軸心之間的角度在20~45度之間。這類轉頭的優(yōu)點是具有較大的容量，速度較高。另一種甩平式轉頭則由一個轉頭上懸吊著6個自由活動的吊桶〔離心管套〕構成。當轉頭靜止時，這些吊柄垂直懸掛；當轉頭在離心力的作用下轉速達到200～800 r／min 時．吊桶即甩平到水平位置。這種轉頭主要是為了密度梯度沉降法而設計的。其主要優(yōu)點是梯度物質可放在保持垂直的離心管中，而離心時管子保持水平。在水平位置沉降到離心管不同區(qū)域的樣品呈現(xiàn)出橫過離心管的帶狀，而不像角式轉頭中那樣成角度。因此，當從轉頭中取出離心管時．不會像在角式轉頭中那樣，沉降成分重新定位。這類轉頭的缺點是：形成區(qū)帶所需的時間間矩長，②分析性超速離心機分析性超速離心機使用了特殊設計的轉頭和檢測系統(tǒng)，以便連續(xù)地監(jiān)視物質在一個離心場的沉降過程。分析性超速離心機的轉頭是橢圓形的，此轉頭通過一個有天性的軸聯(lián)接到一個高速的驅動裝置上。轉頭在一個冷凍的和真空的膠中旋轉。轉頭上有2~6個裝離心杯的小室，離心杯呈扇形，可上下透光。離心機中裝有一個光學系統(tǒng)，在整個離心期間都能通過紫外吸收或折射率的變化監(jiān)測離心杯中沉降著的物質。在預定的時間可以拍攝沉降物質的照片、杯中物質沉降過程中，重顆粒和輕顆粒之間形成的界面就像一個折射的透鏡，在檢測系統(tǒng)的照相底板上產(chǎn)生了一個”峰”，出于沉降不斷進行，界面問前推進，因此峰也移動。從峰移動的速度可以得到物質沉降速度的指標。分析性超速離心機主要用于生物大分子的相對分子質量測定，估算樣艙的純度和檢測生物大分子構象的變化等。PCR技術原理20120307 17:50 來源：達為科 點擊次數(shù)：8434 關鍵詞： PCR 電泳 原理 分享到： 收藏夾 騰訊微博 新浪微博 開心網(wǎng) PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為48h以內，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。，不出現(xiàn)擴增條帶 PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質量與特異性，③酶的質量及活性 ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。模板：①模板中含有雜蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改。酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。引物：引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。反應體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul?；?00ul，應用多大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。物理原因：變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性。退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。，出現(xiàn)非特異性擴增帶出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設計引物。 靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。②除酶及不能耐高溫的物質外，所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。③必要時，在加標本前，反應管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性?？苫ハ嗥唇?，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。其對策有：①必要時重新設計引物。②減低酶量或調換另一來源的酶。③降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。 PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。其對策有：①減少酶量，或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。③適當降低Mg2+濃度。④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。