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2025-05-03 18:39本頁面
【正文】 4與 A2Y相比較而對(duì)應(yīng)的差異片段。將差異片進(jìn)行回收、轉(zhuǎn)化?？寺≥d體為 PMD18T Vector， 按照 α 互補(bǔ)篩選原則，挑取部分白色菌落為模板，按原程序進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳分析，有插入片段的菌落應(yīng)擴(kuò)增出一條與插入片段大小一致的片段，挑取陽性克隆菌落，穿刺培養(yǎng)后由上海博亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序 ，測(cè)序后進(jìn)入GenBank進(jìn)行序列同源性比較。 經(jīng)與 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)比較，發(fā)現(xiàn) AP3片段與 mRNA for small GTPbinding protein 具有同源性。 種蛋白基因被稱為分子開關(guān)，但是否與無融合基因的表達(dá)有關(guān)，需要進(jìn)一步研究 而 AP4為未知基因 而。第二節(jié)抑制消減雜交技術(shù)(Suppression subtractive Hybridization)一、 差別雜交 （ Differential Hybridization)n 差別篩選（ differential Screening) 適用于分離在特定組織中或發(fā)育的特定階段表達(dá)的基因、受生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)的基因、誘導(dǎo)表達(dá)的基因n 技術(shù)原理 擁有兩種不同的細(xì)胞群體：目的基因正常表達(dá) 目的基因不表達(dá)`差別雜交的局限性n 靈敏度比較低n 篩選大量的雜交濾膜，鑒定大量的克隆片段n 重復(fù)性差二、扣除雜交 (subtractive hybridization)n 扣除 cDNA克隆n 減法雜交n 基因組 DNA雜交 三、抑制消減雜交技術(shù)(Suppression subtractiveHybridization)n 抑制消減雜交是 1996年 Diatchenko提出的一種建立在RDA基礎(chǔ)上的差異表達(dá)基因分離方法。n 代表性差別分析(representation difference analysis,RDA)n 通過突變型與野生型基因組之間的差異比較來分離和鑒定突變基因的方法。n cDNA RDA以 RDA為基礎(chǔ)，以 mRNA表達(dá)水平的差異作為差減目標(biāo)。抑制消減雜交技術(shù)的基本原理n 該方法運(yùn)用了雜交二級(jí)動(dòng)力學(xué)原理，及高豐度的單鏈 DNA在退火時(shí)產(chǎn)生同源雜交的速度快于豐度低的單鏈 DNA， 從而使原來在豐度上有差別的單鏈 DNA相對(duì)含量達(dá)到基本一致。而抑制 PCR則利用鏈內(nèi)退火優(yōu)于鏈間退火的特點(diǎn)，使非目的序列片段兩端反向重復(fù)序列在退火時(shí)產(chǎn)生類似發(fā)卡的互補(bǔ)結(jié)構(gòu)，無法作為模板與引物配對(duì)從而選擇性的抑制了非目的基因片段的擴(kuò)增。這樣既利用了消減雜交技術(shù)的消減富集，又利用了抑制 PCR技術(shù)進(jìn)行高效的動(dòng)力學(xué)富集 。抑制消減雜交技術(shù)主要優(yōu)點(diǎn)① 該方法的最大優(yōu)點(diǎn)是降低了假陽性率 ② SSH方法具有高度敏感性③ 降低了起始樣品的使用量 ④ 在一次 SSH反應(yīng)中 ,可以同時(shí)分離出成百個(gè)差異表達(dá)基因 [23]，極大地提高了檢測(cè)效率⑤ 提高了基因克隆的效率，由于使用 4堿基內(nèi)切酶使得基因（組）的復(fù)雜程度降低。 ⑥ 該技術(shù)還具有背景低、重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn) ⑦ 程序相對(duì)簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便易行 SSH技術(shù)的主要缺陷① SSH技術(shù)需要較多的起始材料且更多地依賴于 PCR技術(shù)，若是 mRNA量不夠，低豐度的差異表達(dá)基因cDNA可能檢測(cè)不到 ② 消減庫(kù)中的 cDNA經(jīng)過 Rsal等限制酶消化后，不再是全長(zhǎng) cDNA ③ 不能同時(shí)對(duì)數(shù)個(gè)材料之間進(jìn)行比較 ,材料之間存在過多的差異及小片段缺失也不能有效被檢測(cè) ④ 完全無酶切位點(diǎn)的片段或酶切位點(diǎn)較少的基因組無法用 SSH技術(shù)篩選 ⑤ 利用抑制消減雜交所獲得的片段，須經(jīng)過 Nothern雜交或反 Nothern雜交來進(jìn)一步鑒定，去除假陽性 SSH技術(shù)的主要應(yīng)用 ① 在腫瘤基因克隆中的應(yīng)用 ② 在生殖與發(fā)育基因調(diào)控中的應(yīng)用 ③ 在免疫調(diào)控基因研究中的應(yīng)用 ④ 在代謝調(diào)控機(jī)理研究中的應(yīng)用⑤ 在原核生物分子遺傳分析中的應(yīng)用⑥ 在植物基因克隆上的應(yīng)用
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