mrna及sshppt課件(參考版)
2025-05-06 18:39本頁面
【正文】 ⑥ 該技術(shù)還具有背景低、重復(fù)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn) ⑦ 程序相對(duì)簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便易行 SSH技術(shù)的主要缺陷① SSH技術(shù)需要較多的起始材料且更多地依賴于 PCR技術(shù)，若是 mRNA量不夠，低豐度的差異表達(dá)基因cDNA可能檢測(cè)不到 ② 消減庫(kù)中的 cDNA經(jīng)過 Rsal等限制酶消化后，不再是全長(zhǎng) cDNA ③ 不能同時(shí)對(duì)數(shù)個(gè)材料之間進(jìn)行比較 ,材料之間存在過多的差異及小片段缺失也不能有效被檢測(cè) ④ 完全無酶切位點(diǎn)的片段或酶切位點(diǎn)較少的基因組無法用 SSH技術(shù)篩選 ⑤ 利用抑制消減雜交所獲得的片段，須經(jīng)過 Nothern雜交或反 Nothern雜交來進(jìn)一步鑒定，去除假陽性 SSH技術(shù)的主要應(yīng)用 ① 在腫瘤基因克隆中的應(yīng)用 ② 在生殖與發(fā)育基因調(diào)控中的應(yīng)用 ③ 在免疫調(diào)控基因研究中的應(yīng)用 ④ 在代謝調(diào)控機(jī)理研究中的應(yīng)用⑤ 在原核生物分子遺傳分析中的應(yīng)用⑥ 在植物基因克隆上的應(yīng)用 。這樣既利用了消減雜交技術(shù)的消減富集，又利用了抑制 PCR技術(shù)進(jìn)行高效的動(dòng)力學(xué)富集 。抑制消減雜交技術(shù)的基本原理n 該方法運(yùn)用了雜交二級(jí)動(dòng)力學(xué)原理，及高豐度的單鏈 DNA在退火時(shí)產(chǎn)生同源雜交的速度快于豐度低的單鏈 DNA， 從而使原來在豐度上有差別的單鏈 DNA相對(duì)含量達(dá)到基本一致。n 代表性差別分析(representation difference analysis,RDA)n 通過突變型與野生型基因組之間的差異比較來分離和鑒定突變基因的方法。 種蛋白基因被稱為分子開關(guān)，但是否與無融合基因的表達(dá)有關(guān)，需要進(jìn)一步研究 而 AP4為未知基因 而。克隆載體為 PMD18T Vector， 按照 α 互補(bǔ)篩選原則，挑取部分白色菌落為模板，按原程序進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳分析，有插入片段的菌落應(yīng)擴(kuò)增出一條與插入片段大小一致的片段，挑取陽性克隆菌落，穿刺培養(yǎng)后由上海博亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序 ，測(cè)序后進(jìn)入GenBank進(jìn)行序列同源性比較。 五、 mRNA差別顯示在甜菜無融合生殖基因克隆研究中的應(yīng)用 PCR產(chǎn)物利用 4%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，分離出M14與 A2Y相比較而對(duì)應(yīng)的差異片段。42℃ ,lmin。PCR反應(yīng)程序：94℃ ,5min。（ 2）配制 Master Mix II Master Mix I x N μl cDNA第一鏈 x N μl （ 3）取 μl 10堿基任意引物（ 10 μM）， 分別加到 ml離心管內(nèi)。（ 5） cDNA第一鏈合成結(jié)束后，于試管內(nèi)加入 76 μl TE， 4 μl 50 μM的相同錨定引物， 20 ℃ 貯存。（ 4）將混勻后的試管置于 PCR熱循環(huán)儀內(nèi)，按下列程序合成cDNA第一鏈。 （ 1）共采用三種錨定引物： T15A、 T15G、 T15C （ 2） 制備錨定引物 RNA混合物，變性 RNA樣品 ① DEPCtreated H2O μl 錨定引物 μl ② Total RNA（ μg/ μl） μl ① 混合物 μl混勻，將離心管置于 70℃ 10分鐘，結(jié)束后立即放于冰上 。經(jīng)過標(biāo)記基因雜交、傳遞遺傳形態(tài)觀察、胚胎學(xué)及分子生物學(xué)鑒定它們是兼性無融合生殖的 ,1999年 3月經(jīng)專家鑒定為無融合生殖品系；同時(shí)無融合生殖基因已經(jīng)定位在這條
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