【正文】 器，推壓注射器活塞桿，溶液壓出濾膜，從針管壓出的溶液就是無菌溶液。5．空間采用紫外線和熏蒸滅菌(1) 紫外線滅菌 在接種室、超凈臺上或接種箱里用紫外燈滅菌。紫外線滅菌是利用輻射因子滅菌，細菌吸收紫外線后，蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生結構變化，引起細菌的染色體變異，造成死亡。紫外線的波長為200300nm，其中以260nm．的殺菌能力最強，但是由于紫外線的穿透物質(zhì)的能力很弱，所以只適于空氣和物體表面的滅菌；。(2) 熏蒸滅菌 用加熱焚燒、氧化等方法，使化學藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴散到空氣中，以殺死空氣和物體表面的微生物。這種方法簡便，只需要把消毒的空間關閉緊密即可?；瘜W消毒劑的種類很多，它們使微生物的蛋白質(zhì)變性，或競爭其酶系統(tǒng)，或降低其表面張力，增加菌體細胞漿膜的通透性，使細胞破裂或溶解。一般說來，溫度越高，作用時間越長，殺菌效果越好。另外，由于消毒劑必須溶解于水才能發(fā)揮作用，所以要制成水溶狀態(tài)，如升汞與高錳酸鉀。還有消毒劑的濃度一般是濃度越大，殺菌能力越強，但石炭酸和酒精例外。常用熏蒸劑是甲醛，熏蒸時，房間關閉緊密，按5～8m1／m3用量，將甲醛置于廣口容器中，加5g／m3高錳酸鉀氧化揮發(fā)。熏蒸時，房間可預先噴濕以加強效果。冰醋酸也可進行加熱熏蒸，但效果不如甲醛。6. 一些物體表面用藥劑噴霧滅菌物體表面可用一些藥劑涂擦、噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手、植物材料表面等，可用70％的酒精反復涂擦滅菌，1％～2％％～1％的新潔爾滅也可以。7．植物材料表面用消毒劑滅菌三、外植體的接種和培養(yǎng)從外界或室內(nèi)選取的植物材料，都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶入培養(yǎng)基，便會造成培養(yǎng)基污染。因此，植物材料必須經(jīng)嚴格的表面滅菌處理，再經(jīng)無菌操作手續(xù)接到培養(yǎng)基上，這一過程叫做接種。接種的植物材料叫做外植體(explant)。首先，將采來的植物材料除去不用的部分，將需要的部分仔細洗干凈，如用適當?shù)乃⒆拥人⑾?。把材料切割成適當大小，即滅菌容器能放人為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時，沖洗時間視材料清潔程度而宜。易漂浮或細小的材料，可裝入紗布袋內(nèi)沖洗。流水沖洗在污染嚴重時特別有用。洗時可加入洗衣粉清洗，然后再用自來水沖凈洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物，除去脂質(zhì)性的物質(zhì)，便于滅菌液的直接接觸。當然，最理想的清洗物質(zhì)是表面活性物質(zhì)吐溫第二步是對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈臺或接種箱內(nèi)完成，準備好消毒的燒杯、玻璃棒、70％酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70％酒精浸1030s。由于酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用，加之70％酒精穿透力強，也很易殺傷植物細胞，所以浸潤時間不能過長。有一些特殊的材料，如果實、花蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗，多層鱗片的休眠芽等等，以及主要取用內(nèi)部的材料，則可只用70％酒精處理稍長的時間。處理完的材料在無菌條件下，待酒精蒸發(fā)后再剝除外層，取用內(nèi)部材料第三步是用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多，可根據(jù)情況選取1～2種使用見表１3表13 常用滅菌劑使用濃度及效果比較表滅菌劑使用濃度持續(xù)時間／min去除的難易效果次氯酸鈣9％～10％5～30易很好次氯酸鈉2％5～30易很好氯化汞0．1％，1％5～8較難最好抗菌素4～50mg／L3060中較好上述滅菌劑應在使用前臨時配制，氯化汞可短期內(nèi)貯用。次氯酸鈉和次氯酸鈣都是利用分解產(chǎn)生氯氣來殺菌的，故滅菌時用廣口瓶加蓋較好；升汞是由重金屬汞離子來達到滅菌的；過氧化氫是分解中釋放原子態(tài)氧來殺菌的，這種藥劑殘留的影響較小，滅菌后用無菌水涮洗3～4次即可；由于用升汞液滅菌的材料，難以對升汞殘毒較難去除，所以應當用無菌水涮洗8～10次，每次不少于3min，以盡量去除殘毒。滅菌時，把瀝干的植物材料轉放到燒杯或其他器皿中，記好時間，倒人消毒溶液，不時用玻璃棒輕輕攪動，以促進材料各部分與消毒溶液充分接觸，驅(qū)除氣泡，使消毒徹底。在快到時間之前1～2min，開始把消毒液傾人一備好的大燒杯內(nèi)，要注意勿使材料倒出，傾凈后立即倒入無菌水，輕攪涮洗。滅菌時間是從倒入消毒液開始，至倒人無菌水時為止。記錄時間還便于比較消毒效果，以便改正。滅菌液要充分浸沒材料，寧可多用些滅菌液，切勿勉強在一個體積偏小的容器中使用很多材料滅菌。在滅菌溶液中加吐溫80或Triton X效果較好，這些表面活性劑主要作用是使藥劑更易于展布，更容易浸入到滅菌的材料表面。但吐溫加入后對材料的傷害也在增加，應注意吐溫的用量和滅菌時間，％，即在100ml加入15滴。最后一步是用無菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，視采用的消毒液種類，涮洗3～10次左右。無菌水涮洗作用是免除消毒劑殺傷植物細胞的副作用。（一）外植體的接種——無菌操作1．無菌操作接種時由于有一個敞口的過程，所以是極易引起污染的時期，這一時期主要由空氣中的細菌和工作人員本身引起，接種室要嚴格進行空間消毒。接種室內(nèi)保持定期用1％～3％的高錳酸鉀溶液對設備、墻壁、地板等進行擦洗。除了使用前用紫外線和甲醛滅菌外，還可在使用期間用70％的酒精或3％的來蘇兒噴霧，使空氣中灰塵顆粒沉降下來。無菌操作可按以下步驟進行：(1) 在接種4h前用甲醛熏蒸接種室，并打開其內(nèi)紫外燈進行滅菌； (2) 在接種前20rain，打開超凈工作臺的風機以及臺上的紫外燈；(3) 接種員先洗凈雙手，在緩沖間換好專用實驗服，并換穿托鞋等；(4) 上工作臺后，用酒精棉球擦拭雙手，特別是指甲處。然后擦拭工作臺面； (5) 先用酒精棉球擦拭接種工具，再將鑷子和剪子從頭至尾過火一遍，然后反復過火尖端處，對培養(yǎng)皿要過火烤干；(6) 接種時，接種員雙手不能離開工作臺，不能說話、走動和咳嗽等；(7) 接種完畢后要清理干凈工作臺，可用紫外燈滅菌30rain。若連續(xù)接種，每5天要大強度滅菌一次。2. 接種接種是將已消毒好的根、莖、葉等離體器官，經(jīng)切割或剪裁成小段或小塊，放人培養(yǎng)基的過程。以上已敘述接種前的材料表面的消毒滅菌，現(xiàn)將接種前后的程序連貫地介紹。(1) 將初步洗滌及切割的材料放人燒杯，帶入超凈臺上，用消毒劑滅菌，再用無菌水沖洗，最后瀝去水分，取出放置在滅過菌的4層紗布上或濾紙上。(2) 材料吸干后，一手拿鑷子，一手拿剪子或解剖刀，對材料進行適當?shù)那懈睢?；莖切成含有一個節(jié)的小段。微莖尖要剝成只含1～2片幼葉的莖尖大小等。在接種過程中要經(jīng)常灼燒接種器械，防止交叉污染。(3) 用灼燒消毒過的器械將切割好的外植體插植或放置到培養(yǎng)基上。具體操作過程是：先解開包口紙，將試管幾乎水平拿著，使試管口靠近酒精燈火焰，并將管口在火焰上方轉動，使管口里外灼燒數(shù)秒鐘。若用棉塞蓋口，可先在管口外面灼燒，去掉棉塞，再燒管口里面。然后用鑷子夾取一塊切好的外植體送人試管內(nèi)，輕輕插入培養(yǎng)基上。若是葉片直接附在培養(yǎng)基上，以放1～3塊為宜。至于材料放置方法除莖尖、莖段要正放(尖端向上)外，其他尚無統(tǒng)一要求。放置材料數(shù)量現(xiàn)在傾向少放，通過統(tǒng)計認為：對外植體每次接種以一支試管放一枚組塊為宜，這樣可以節(jié)約培養(yǎng)基和大力，一旦培養(yǎng)物污染可以拋棄。接完種后，將管口在火焰上再灼燒數(shù)秒鐘。并用棉塞，塞好后，包上包口紙，包口紙里面也要過火。（二）外植體的培養(yǎng)和馴化培養(yǎng)指把培養(yǎng)材料放在培養(yǎng)室(有光照、溫度條件)里，使之生長，分裂和分化形成愈傷組織或進一步分化成再生植株的過程。1．培養(yǎng)方法(1) 固體培養(yǎng)法即用瓊脂固化培養(yǎng)基來培養(yǎng)植物材料的方法。是現(xiàn)在最常用的方法。雖然該方法設備簡單，易行，但養(yǎng)分分布不均，生長速度不均衡，并常有褐化中毒現(xiàn)象發(fā)生。(2) 液體培養(yǎng)法即用不加固化劑的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)植物材料的方法。由于液體中氧氣含量較少，所以通常需要通過攪動或振動培養(yǎng)液的方法以確保氧氣的供給，采用往復式搖床或旋轉式搖床進行培養(yǎng)，其速度一般為50～100r／min，這種定期浸沒的方法，既能使培養(yǎng)基均一，又能保證氧氣的供給。2．培養(yǎng)步驟(1)初代培養(yǎng)初代培養(yǎng)旨在獲得無菌材料和無性繁殖系。即接種某種外植體后，最初的幾代培養(yǎng)。初代培養(yǎng)時，常用誘導或分化培養(yǎng)基，即培養(yǎng)基中含有較多的細胞分裂素和少量的生長素。初代培養(yǎng)建立的無性繁殖系包括：莖梢、芽叢、胚狀體和原球莖等。根據(jù)初代培養(yǎng)時發(fā)育的方向可分為1) 頂芽和腋芽的發(fā)育采用外源的細胞分裂素，可促使具有頂芽或沒有腋芽的休眠側芽啟動生長，從而形成一個微型的多枝多芽的小灌木叢狀的結構。在幾個月內(nèi)可以將這種叢生苗的一個枝條轉接繼代，重復芽苗增殖的培養(yǎng)，并且迅速獲得多數(shù)的嫩莖。然后將一部分嫩莖轉移到生根培養(yǎng)基上，就能得到可種植到土壤中去的完整的小植株。一些木本植物和少數(shù)草本植物也可以通過這種方式來進行再生繁殖，如月季、茶花、菊花、香石竹等等。這種繁殖方式也稱作微型扦插，它不經(jīng)過發(fā)生愈傷組織而再生，所以是最能使無性系后代保持原品種特性的一種繁殖方式。適宜這種再生繁殖的植物，在采樣時，只能采用頂芽、側芽或帶有芽的莖切段，其他如種子萌發(fā)后取枝條也可以。莖尖培養(yǎng)可看作是這方面較為特殊的一種方式。它采用極其幼嫩的頂芽的莖尖分生組織作為外植體進行接種。在實際操作中，采用包括莖尖分生組織在內(nèi)的一些組織來培養(yǎng)，這樣便保證了操作方便以及容易成活。用靠培養(yǎng)定芽得到的培養(yǎng)物一般是莖節(jié)較長，有直立向上的莖梢，擴繁時主要用切割莖段法，如香石竹、矮牽牛、菊花等。但特殊情況下也會生出不定芽，形成芽叢。2) 不定芽的發(fā)育在培養(yǎng)中由外植體產(chǎn)生不定芽，通常首先要經(jīng)脫分化過程，形成愈傷組織的細胞。然后，經(jīng)再分化，即由這些分生組織形成器官原基，它在構成器官的縱軸上表現(xiàn)出單向的極性(這與胚狀體不同)。多數(shù)情況下它先形成芽，后形成根。另一種方式是從器官中直接產(chǎn)生不定芽，有些植物具有從各個器官上長出不定芽的能力如矮牽牛、福祿考、懸鉤子等。當在試管培養(yǎng)的條件下，培養(yǎng)基中提供了營養(yǎng)，特別是提供了連續(xù)不斷植物激素的供應，使植物形成不定芽的能力被大大地激發(fā)起來。許多種類的外植體表面幾乎全部為不定芽所覆蓋。39。在許多常規(guī)方法中不能無性繁殖的種類，在試管條件下卻能較容易地產(chǎn)生不定芽而再生，如柏科，松科，銀杏等一些植物。許多單子葉植物儲藏器官能強烈地發(fā)生不定芽，用百合鱗片的切塊就可大量形成不定鱗莖。在不定芽培養(yǎng)時，也常用誘導或分化培養(yǎng)基。用靠培養(yǎng)不定芽得到的培養(yǎng)物，一般采用芽叢進行繁殖，如非洲菊、草莓等。3) 體細胞胚狀體的發(fā)生與發(fā)育體細胞胚狀體類似于合子胚但又有所不同，它也通過球形，心形，魚雷形和子葉形的胚胎發(fā)育時期，最終發(fā)育成小苗。但它是由體細胞發(fā)生的。胚狀體可以從愈傷組織表面產(chǎn)生，也可從外植體表面已分化的細胞中產(chǎn)生，或從懸浮培養(yǎng)的細胞中產(chǎn)生。4) 初代培養(yǎng)外植體的褐變外植體褐變是指在接種后，其表面開始褐變，有時甚至會使整個培養(yǎng)基褐變的現(xiàn)象。它的出現(xiàn)是由于植物組織中的多酚氧化酶被激活，而使細胞的代謝發(fā)生變化所致。在褐變過程中，會產(chǎn)生醌類物質(zhì)，它們多呈棕褐色，當擴散到培養(yǎng)基后，就會抑制其他酶的活性，從而影響所接種外植體的培養(yǎng)。四、外植體的成苗途徑外植體的成苗途徑有3種（圖110）第一種，外植體先形成愈傷組織，然后分化成完整的植株。第二種，形成胚狀體，再發(fā)育成完整植株。第三種，外植體經(jīng)誘導后直接形成根和芽，發(fā)育成完整的植株。五、污染的原因及其預防措施（一）污染的原因（二）污染的預防措施1．防止材料帶菌的措施2. 外植體的滅菌3. 器皿與金屬器械的滅菌六、外植體的褐變及其防止措施（一）褐變的原因：①植物品種 研究表明，在不同品種間的褐變現(xiàn)象是不同的。由于多酚氧化酶活性上的差異，因此，有些花卉品種的外植體在接種后較容易褐變，而有些花卉品種的外植體在接種后不容易褐變。因此，在培養(yǎng)過程中應該有所選擇，對不同的品種分別進行處理。②生理狀態(tài) 由于外植體的生理狀態(tài)不同，所以在接種后褐變程度也有所不同。一般來說，處于幼齡期的植物材料褐變程度較淺，而從已經(jīng)成年的植株采收的外植體，由于含醌類物質(zhì)較多，因此褐變較為嚴重。一般來說，幼嫩的組織在接種后褐變程度并不明顯，而老熟的組織在接種后褐變程度較為嚴重。③培養(yǎng)基成分 濃度過高的無機鹽會使某些觀賞植物的褐變程度增加，此外，細胞分裂素的水平過高也會刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現(xiàn)象加深。④培養(yǎng)條件不當 如果光照過強、溫度過高、培養(yǎng)時間過長等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的外植體的褐變程度。（二）褐變的防止措施為了提高組織培養(yǎng)的成苗率，必須對外植體的褐變現(xiàn)象加以控制。可以采用以下措施防止、減輕褐變現(xiàn)象的發(fā)生。①選擇合適的外植體 一般來說，最好選擇生長處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。②合適的培養(yǎng)條件 無機鹽成分、植物生長物質(zhì)水平、適宜溫度、及時繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。③使用抗氧化劑 在培養(yǎng)基中，使用半胱氨酸、抗壞血酸等抗氧化劑能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。％～％的活性炭對防止褐變也有較為明顯的效果。④連續(xù)轉移 對容易褐變的材料可間隔1224h的培養(yǎng)后，再轉移到新的培養(yǎng)基上，這樣經(jīng)過連續(xù)處理7lOd后，褐變現(xiàn)象便會得到控制或大為減輕。七、培養(yǎng)物的玻璃化現(xiàn)象及其預防措施（1）繼代培養(yǎng)在初代培養(yǎng)的基礎上所獲得的芽、苗、胚狀體和原球莖等，數(shù)量都還不多，它們需要進一步增殖，使之越來越多，從而發(fā)揮快速繁殖的優(yōu)勢。繼代培養(yǎng)是繼初代培養(yǎng)之后的連續(xù)數(shù)代的擴繁培養(yǎng)過程。旨在繁殖出相當數(shù)量的無根苗，最后能達到邊繁殖邊生根的目的。繼代培養(yǎng)的后代是按幾何級數(shù)增加的過程。如果以2株苗為基礎，那么經(jīng)10代將生成1024株苗。繼代培養(yǎng)中擴繁的方法包括：切割莖段、分離芽叢、分離胚狀體、分離原球莖等。切割莖段常用于有伸長的莖梢、莖節(jié)較明顯的培養(yǎng)物。這種方法簡便易行，能保持母種特性。培養(yǎng)基常是MSo基本培養(yǎng)基；分離芽叢適于由愈傷組織生出的芽叢。培養(yǎng)基常是分化培養(yǎng)基。若芽叢的芽較小。可先切成芽叢小塊，放入MS。培養(yǎng)基中，待到稍大時，再分離開來繼續(xù)培養(yǎng)。增殖使用的培養(yǎng)摹對于一種植物來說每次幾乎完全相同，由于培養(yǎng)物在接近最良好的環(huán)境條件，營養(yǎng)供應和激素調(diào)控下，排除了其他生物的競爭，所以能夠按幾何級數(shù)增殖。在快速繁殖中初代培養(yǎng)只是一個必經(jīng)的過程，而繼