【導(dǎo)讀】1生化分離工程的定義：為提取生物產(chǎn)品時(shí)所需的原理、方法、技術(shù)及相關(guān)硬件設(shè)備的總稱，指從發(fā)酵液、動(dòng)植物。生物技術(shù)的主要目標(biāo)是生。物物質(zhì)的高效生產(chǎn)，分離純化是生物產(chǎn)品工程的重要環(huán)節(jié)，因此生物分離是生物技術(shù)的重要組成部分。種類繁多，包括自然界存在的各種生物資源。產(chǎn)品的主體是蛋白質(zhì)藥物。速率分離—膜分離、電滲析、透析。、分子電荷及影響因素，包括pH值和鹽等；、穩(wěn)定性及其影響因素，包括溫度、pH值、毒性試劑等；溶質(zhì)達(dá)到相間平衡的過程為擴(kuò)散傳質(zhì)過程，平衡分離又稱擴(kuò)散分離。

　　

【正文】 多糖則以 1～ 2％較合適。 中性鹽濃度 ：較低濃度的中性鹽存在有利于沉淀作用，減少蛋白質(zhì)變性。一般中性鹽濃度以 ～ ，常用的中性鹽為醋酸鈉、醋酸銨、氯化 鈉等。 某些金屬離子 ：一些金屬離子如 Ca2+、 Zn2+等可與某些成陰離子狀態(tài)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合物，這種復(fù)合物溶解度大大降低而不影響生物活性，有利于沉淀形成，并降低溶劑用量。 優(yōu)點(diǎn)： A、某些蛋白質(zhì)沉淀的濃度范圍相當(dāng)寬，所得產(chǎn)品的純度較高 B、從沉淀的蛋白質(zhì)中除去有機(jī)溶劑很方便，而且有機(jī)溶劑本身可部分地作為蛋白質(zhì)的殺菌劑； 缺點(diǎn)： A、耗用大量溶劑，而溶劑來源、貯存都比較困難麻煩； B、且沉淀操作需在低溫下進(jìn)行，使用上有一定的局限性； C、收率也比鹽析法低； D、試劑易燃，有毒。 熱沉淀 利用生物 大分子對(duì)熱的穩(wěn)定性不同，加熱升高溫度使某些非目的生物大分子變性沉淀而保留目的物在溶液中。此方法最為簡(jiǎn)便，不需消耗任何試劑，但分離效率較低，通常用于生物大分子的初期分離純化。 非離子型聚合物沉淀法 用聚乙二醇等非離子性聚合物亦能降低蛋白質(zhì)的溶解度，有選擇性的沉淀蛋白質(zhì)。 機(jī)理 ：與有機(jī)溶劑相似，能降低水活度，破壞蛋白質(zhì)的水化膜。 常用非離子性聚合物為 (PEG)： 是一種水溶性的高分子聚合物，分子量 4,000 以上的 PEG 可以用來沉淀蛋白質(zhì)。 優(yōu)點(diǎn) ： 1. 室溫 2. 顆粒大，易于收集 3. 提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性 4. PEG 難去除，幸而 PEG 通常一般不影響下一步的分離。 優(yōu)點(diǎn)： A、體系的溫度只需控制在室溫條件下； B、沉淀的顆粒往往比較大，產(chǎn)物比較容易收集； C、 PEG 非但不會(huì)使 pro 變性 ,而且可以提高它的穩(wěn)定性； D、 PEG 無毒，優(yōu)先使用在臨床產(chǎn)品的加工過程中。 缺點(diǎn)： A、 PEG 比其他沉淀劑更難從蛋白質(zhì)溶液中除去為此需用超濾和液 液萃取來解決； B、價(jià)格較昂貴。 選擇性沉淀法： 概念 ：選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白等雜質(zhì)變性沉淀下來，而與目的物分開。 原理 ：利用蛋白質(zhì) 、酶和核酸等生物大分子對(duì)某些物理或化學(xué)因素敏感性不同，有選擇地使之變性沉淀，以達(dá)到分離提純的目的。 方法 ：１）利用對(duì)熱的不穩(wěn)定性 ,加熱破壞某些組分，而保存另一些組分；２）酸堿變性。 ３）利用表面活性劑 (三氯乙酸 )或有機(jī)溶劑引起變性； 選擇性變性沉淀法 選擇性變性沉淀法是使 雜質(zhì) 變性沉淀，又對(duì)目的物沒有明顯影響，所以在操作之前要對(duì)欲分離的物質(zhì)中的雜蛋白等雜質(zhì)的種類、含量及其物理化學(xué)性質(zhì)等有比較全面的了解。例如對(duì)于α 淀粉酶等熱穩(wěn)定性好的酶，可以通過加熱進(jìn)行熱處理，使大多數(shù)雜蛋白受熱變性沉淀而被除去。 選擇性沉淀 法－選擇性分離核酸： 酚、氯仿、十二烷基磺酸鈉等 目的是使核酸和蛋白質(zhì)分離，蛋白質(zhì)變性沉淀，核酸則存在于水溶液中。在核酸提取液中加入氯仿 戊醇，振蕩一段時(shí)間、使蛋白質(zhì)在氯仿 水的界面上形成沉淀而被除去，核酸仍然留在水溶液中。在 DNA、 RNA 混合溶液中，用異丙醇選擇性地沉淀 DNA，而 RNA 留在溶液中。 其他沉淀法： 聚電解質(zhì)（ polyelectrolytes) 機(jī)理：架橋作用 鹽析 降低水化度 多價(jià)金屬離子 (polyvalent metal ions) 機(jī)理： 與蛋白質(zhì)分子上某些殘基發(fā)生相互作用 各種沉淀方法 應(yīng)用范圍： 鹽析法 ：多用于各種蛋白質(zhì)和酶的分離純化。 有機(jī)溶劑沉淀法 ：多用于生物小分子、多糖及核酸的分離純化，有時(shí)也用于蛋白質(zhì)沉淀。 等電點(diǎn)沉淀法 ：用于氨基酸、蛋白質(zhì)等兩性物質(zhì)的沉淀。多與其它方法結(jié)合使用。 非離子多聚體沉淀法 ：用于分離生物大分子。 生成鹽復(fù)合物沉淀 ：用于多種物質(zhì) (特別是小分子 ) 選擇性沉淀（熱 /酸堿變性沉淀）： 多用于除去某些不耐熱的和在一定 pH 值下易變性的雜蛋白。 泡沫分離 泡沫分離原理 表面張力與表面吸附 向水中加入表面活性劑，水溶液的表面張力隨表 面活性劑濃度的增大而下降。當(dāng)表面活性劑濃度達(dá)到一定值后，將發(fā)生表面活性劑分子的締合或自聚集，形成水溶性膠團(tuán)。 表面活性劑在水溶液中形成膠團(tuán)的最低濃度稱為臨 界膠團(tuán)濃度（ CMC） 在氣液兩相界面處的表面活性物質(zhì)濃度與主體溶液不同，這種現(xiàn)象稱為 表面過剩 。表面過剩量可用 Gibbs 吸附等溫式表達(dá) 吉布斯吸附等溫式應(yīng)用于雙組分體系稀溶液中的特殊形式 從式中可看出，吸附量 Γ 2(1) 的符號(hào)取決于表面張力隨濃度的變化率 dγ /dc，若 dγ /dc0 ，則 Γ 0 ，溶質(zhì)發(fā)生正吸附；這時(shí)溶質(zhì)在表面上的濃度比溶液內(nèi)部的大； 反之，當(dāng) dγ /dc0 ，溶質(zhì)發(fā)生負(fù)吸附，這時(shí)溶質(zhì)在表面上的濃度比溶液內(nèi)部的小，即溶劑在表面上的含量更多。 泡沫分離 在臨界膠團(tuán)濃度以下，表面活性劑溶液的表面張力隨表面活性劑濃度的增大而降低， dγ /dc0 ，則 Γ 0 ，溶質(zhì)發(fā)生正吸附；這時(shí)溶質(zhì)在表面上的濃度比溶液內(nèi)部的大； 所以表面活性物質(zhì)在表面上聚集。不同溶質(zhì)的表面活性不同， 在界面的濃聚行為不同，因此可以用泡沫吸附技術(shù)進(jìn)行分級(jí)分離。 對(duì)于表面活性物質(zhì)，可借用 Langmuir 吸附等溫式來表示表面活性物質(zhì)在溶液表面的吸咐。 k 為一經(jīng)驗(yàn)常數(shù)，與 溶質(zhì)的表面活性大小有關(guān)。 由這個(gè)關(guān)系式知：（ 1） 低濃度時(shí)， c 很小， kc1， Γ =Γ ∞ kc，即 Γ 與 c 為直線關(guān)系；（ 2） 高濃度時(shí)， c 很大， kc1，Γ =Γ ∞， Γ ∞ ——飽和吸附量，再增加濃度， Γ 也不會(huì)增大，表明溶液表面吸附達(dá)到最大吸附量，不可能有更多的溶質(zhì)被吸附在溶液表面。這個(gè)吸附量的極限值就稱為飽和吸附量。（ 3） 中等濃度時(shí)， Γ 與 c 為曲線關(guān)系。 泡沫的形成和結(jié)構(gòu) 泡沫分離設(shè)備和過程 泡沫分離設(shè)備主要有泡沫柱和消泡器構(gòu)成 消泡液回流 —目標(biāo)產(chǎn)物濃度較高，純化倍數(shù)也較大，但產(chǎn)品回收 率較低，適用于濃縮純化；消泡液不回流則相反，適用于提取回收。 多柱串聯(lián) —可獲得較高的收率和分離純化效果 高速攪拌表面活性劑溶液可制備膠質(zhì)氣體泡沫（ CGA）， CGA 與液料接觸，可吸附分離目標(biāo)產(chǎn)物 泡沫分離的應(yīng)用 泡沫分離優(yōu)勢(shì) ：設(shè)備簡(jiǎn)單，易于放大；操作簡(jiǎn)便，能耗低；可連續(xù)和間歇操作；可出來體積龐大的稀料液；可直接用于處理含有細(xì)胞或細(xì)胞碎片的料液；可以獲得很高分離效率 影響分離操作的主要因素 ：液料性質(zhì)、表面活性劑、操作條件、泡沫柱 胰蛋白酶的提取 從動(dòng)物胰臟中提取胰蛋白酶工藝 ? 胰蛋白酶原的溶解：酸 性條件下穩(wěn)定 ? 溶解液中含有大量的酸性雜蛋白（ pI ) ? 濃縮分離胰蛋白酶原（鹽析） ? 溶解激活（酶原 酶） ? 胰蛋白酶的進(jìn)一步分離：酶溶液中糜蛋白彈性蛋白等與胰蛋白酶在不同的鹽濃度下溶解度不同 （一）豬胰蛋白酶原的提取（二）胰蛋白酶原激活（三）胰蛋白酶的分離 討論題：咸蛋煮熟了，蛋黃里會(huì)有油，這是什么緣故？ 熟鴨蛋蛋黃中脂肪的含量高達(dá) 31％，為什么看不到一點(diǎn)油？可是在熟咸蛋的蛋黃中，卻經(jīng)常可以看到黃色的油滴往外流？ 蛋黃中除了脂肪以外，還含有豐富的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)就是一種高明的乳化劑，它能夠把蛋黃中的脂肪分 散成很小的油滴，這樣就騙過了我們的眼睛和舌頭。在鹽漬過程中，作為乳化劑的蛋白質(zhì)被鹽析出來，乳濁液被破壞了，那些原來分散成極小的油滴，彼此就互相聚集起來，變成大油液，使得整個(gè)蛋黃變成油滋滋的，甚至流出油來了。 第四章 膜分離 8 膜分離的概念：利用膜的選擇性（孔徑大?。?，以膜的兩側(cè)存在的能量差作為推動(dòng)力，由于溶液中各組分透過膜的遷移率不同而實(shí)現(xiàn)分離的一種技術(shù)。 在一種流體相間有一層薄的凝聚相物質(zhì)，把流體相分隔開來成為兩部分，這一薄層物質(zhì)稱為膜。膜本身是均一的一相或由兩相以上凝聚物構(gòu)成的復(fù)合體，被膜分開的流體相物 質(zhì)是液體或氣體，膜的厚度應(yīng)在 以下，否則不能稱其為膜。 優(yōu)點(diǎn) : 1)、能耗低。膜分離不涉及相變，對(duì)能量要求低，與蒸餾、結(jié)晶和蒸發(fā)相比有較大的差異； 2)、分離條件溫和，對(duì)于熱敏感物質(zhì)的分離很重要； 3)、操作方便，結(jié)構(gòu)緊湊、維修成本低、易于自動(dòng)化。 缺點(diǎn) 1)、膜面易發(fā)生污染，膜分離性能降低，故需采用與工藝相適應(yīng)的膜面清洗方法； 2)、穩(wěn)定性、耐藥性、耐熱性、耐溶劑能力有限，故使用范圍有限； 3)、單獨(dú)的膜分離技術(shù)功能有限，需與氣他分離技術(shù)連用。 膜分離技術(shù)的類型： 以推動(dòng)力的過程分類 以濃度差為 推動(dòng)力的過程 ： A、透析技術(shù) (Dialysis, DS) 以電場(chǎng)力為推動(dòng)力的過程 ： A、電透析， B、離子交換電透析 以靜壓力差為推動(dòng)力的過程 ： A、微濾， B、超濾， C、反滲透 以蒸氣壓差為推動(dòng)力的過程： A、膜蒸餾， B、滲透蒸餾 以分離應(yīng)用領(lǐng)域過程分類 微濾 (MF) 超濾 (UF) 反滲透 (RO) 透析 (DS) 電透析 (ED) 納米膜分離 (RO) 親和過濾 ( AF) 滲透氣化 (PV) 各種膜分離法及其原理 反滲透 (RO) 滲透現(xiàn)象：當(dāng) B 側(cè)與 A 側(cè)之間的壓差等于滲透壓時(shí)，膜兩側(cè)的化學(xué)勢(shì)相等 ，達(dá)到平衡 意義： A、膜的選擇性。 B、壓力的選擇性。壓力越高，透過液中溶質(zhì)的濃度越低。因此，提高反滲透的壓力有利于實(shí)現(xiàn)溶質(zhì)的高度濃縮，或提高海水淡化質(zhì)量。 應(yīng)用： A、海水淡化， B、超純水制備， C、抗生素和氨基酸等濃縮， D、回收有機(jī)溶劑，如乙醇、丁醇和丙醇等。 微濾 (MF) 原理：篩分，同一般過濾有很大重疊。 操作：同一般過濾。膜兩側(cè)的滲透壓可忽略，操作壓在 。 用途：除去 —10um 的顆粒，用于細(xì)胞、細(xì)菌、細(xì)胞器的分離。 超濾 (UF) 原理：篩分 操作：一般采用 切向流體 ，以減少 固相沉積 。膜兩 側(cè)的滲透壓很小，操作壓在 。 應(yīng)用： A、高分子溶質(zhì)之間，以及高分子與小分子溶質(zhì)之間的分離； B、 Pro 濃縮， C、病毒的分離和富積， D、回收細(xì)胞，處理膠體懸浮液。 計(jì)算： CarmanKozeny 方程 (見上 )。 優(yōu)點(diǎn)： A、消除了濾餅的阻力，過濾效率高； B、超濾回收率高； C、濾液的質(zhì)量好； D、減少處理步驟 透析 (DS) 原理：濃差擴(kuò)散 操作： 用途： A、人工腎，腹膜透析； B、樣品脫電解質(zhì)； C、濃縮富積； D、氣體分 離 (利用透析袋對(duì)不同氣體的通透性 ) 優(yōu)點(diǎn)： A、方法和設(shè)備簡(jiǎn)單，價(jià)格低廉； B、實(shí)驗(yàn)室最常用的樣品脫鹽方法 缺點(diǎn)： A、透析的速度緩慢； B、溶質(zhì)稀釋。 電透析 (ED， IEED) 原理：在透析的基礎(chǔ)上加上直流電，極大加快離子的透析速度。 操作： 用途：樣品快速脫鹽。 優(yōu)點(diǎn)： A、設(shè)備簡(jiǎn)單， B、透析速度極快（提高幾十倍）， C、電流直接指示電透析終點(diǎn)， D、減輕溶質(zhì)的稀釋。 終點(diǎn)判斷： A、 Cl + Ag+ = AgCl? 。 B、電導(dǎo)恒定 . 離子交換電透析 (IEED) 機(jī)理：透析膜經(jīng)化學(xué)處理后帶有正電荷 (如季銨基 —N+R3) 或負(fù)電荷基團(tuán)如 (磺酸基 —SO23)。 操作：幾百對(duì) 用途： A、海水淡化， B、苦水淡化， C、血漿、 IgG、其他蛋白質(zhì)的分離， D、氨基酸和有機(jī)酸分離純化。 優(yōu)點(diǎn)：可大規(guī)模生產(chǎn) 缺點(diǎn)：能耗高 滲透氣化 滲透氣化（ pervaporation, PV) 是根據(jù)溶質(zhì)間 透過膜的速度不同 , 使混合物得到分離 . 滲它是利用膜與被分離有機(jī)液體混合物中各組分的 親合力不同 ，而有選擇性地優(yōu)先吸附溶液某一組分，及各 組分在膜中 擴(kuò)散速度 不同，來達(dá)到 分離 的目的。因此它不存在蒸餾法中的 共沸點(diǎn) 的限制，可連續(xù)分離、濃縮，直至得到純有機(jī)物。 分離過程是用一張 滲透蒸發(fā)膜 ,將進(jìn)料液相和透過氣相分隔開 ,并在氣相側(cè)抽真空或通以惰性氣流 ,把 滲透組分的蒸氣壓控制到接近零 ,液相中產(chǎn)生的 化學(xué)位梯度 （溶質(zhì)分壓差）作為傳質(zhì)推動(dòng)力的膜分離過程。 透蒸發(fā)（膜蒸餾）原理 滲透蒸發(fā)膜類型： A、優(yōu)先透水膜 材料：主要由 親水材料 制成。 如親水聚合物：含氮原子的殼聚糖衍生物、聚烯丙基胺、交聯(lián)聚乙烯醇復(fù)合物；殼聚糖、纖維素及衍生物、鈷交聯(lián)藻朊酸 、磺化聚乙烯離子膜和玻璃紙等。 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：這些膜具有很強(qiáng)的 脫水能力 ，主要在于其高聚物結(jié)構(gòu)上存在著大量的親水基團(tuán)，如羥基、胺基、銨基陽離子等。這些基團(tuán)的存在使得膜具有很高的吸附水和擴(kuò)散水的能力。 應(yīng)用：有機(jī)溶液的脫水 (有機(jī)物為主體，水含量少 )。 B、優(yōu)先透有機(jī)物膜 材料：主要由 憎水高聚物 制成。 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：聚合物中含憎水的氟原子和硅原子等。這些結(jié)構(gòu)對(duì)有機(jī)溶劑的親和力很大，但對(duì)水的無親和力。 應(yīng)用：主要用于水的純化、污染控制和有機(jī)物的回收等 (水為主體，有機(jī)物含量少 )。 滲透蒸發(fā)的特點(diǎn)： 有優(yōu)點(diǎn)，也有缺點(diǎn) A、單 級(jí) 選擇性好 是 滲透蒸發(fā)的最大特點(diǎn)。從理論上講，滲透蒸發(fā)的分離度是無限的， 適合分離沸點(diǎn)相近的物質(zhì) ，尤其是 恒沸物 的分離，對(duì)于回收含量低的溶劑也是一種好方法。 B、過程操作 簡(jiǎn)單 ，易于掌握，有部分