【正文】 年左右，酵母菌可保存 4個月左右，無芽孢的細菌可保存 1個月左右。超過上述時間，就需要進行移種。 微生物菌種的保藏 目的要求 了解菌種保藏的基本原理 掌握幾種常用的菌種保藏方法。 微生物菌種的保藏 實驗原理 菌種保藏的方法很多。其原理卻大同小異，不外乎為優(yōu)良菌株創(chuàng)造一個適合長期休眠的環(huán)境 ,即干燥、低溫、缺乏氧氣和養(yǎng)料等。使微生物的代謝活動處于最低的狀態(tài)，但又不至于死亡，從而達到保藏的目的。依據(jù)不同的菌種或不同的需求，應該選用不同的保藏方法。一般情況下，斜面保藏、半固體穿刺、石蠟油封存和砂土管保藏法較為常用，也比較容易制作。 微生物菌種的保藏 試劑與器材 材料 各種需要保藏的菌種及相應的培養(yǎng)基、河砂、瘦黃土或紅土。 試劑 EDTA、 NaAc、 10mmol/LTris、液體石蠟、甘油、五氧化二磷、 95%乙醇、 10%鹽酸、無水氯化鈣、食鹽、干冰。 器材 無菌吸管、無菌滴管、無菌培養(yǎng)皿、安瓿瓶、凍干管、 40目與 100目篩子、油紙、濾紙條、干燥器、真空泵、真空壓力表、噴燈、 L形五通管、冰箱、 微生物菌種的保藏 斜面低溫保藏 這是一種常用的而且是最簡便的保藏方法。首先將要保藏的菌種移接到適宜的斜面培養(yǎng)基上。一般采用營養(yǎng)豐富的半合成培養(yǎng)基，如 PDA培養(yǎng)基，麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基等。為了減少培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，延長保藏時間，可將瓊脂用量加到 20%。在這些培養(yǎng)基中，最好再加入少許 %的 K2HP0 KH2PO CaCO3等緩沖劑，以中和菌種在保藏過程中產(chǎn)生積累的有機酸。 用適宜溫度培養(yǎng)至菌絲長滿斜面，選擇菌絲生長健壯的試管，先用硫酸紙包扎好管口棉塞，再將若干支試管用牛皮紙包好。 微生物菌種的保藏 液體石蠟保藏 將要保藏的菌種接入前面介紹的馬鈴薯半合成培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至菌絲長滿斜面，選擇生長健壯的備用。然后選用化學純的液體石蠟裝入三角瓶內(nèi)，裝至瓶體的１ /3處，塞上棉塞后包扎，１ kg/cm2滅菌１小時。滅菌后，放在40℃ 恒溫箱中，使水分蒸發(fā)至石蠟液透明為止。冷卻后在無菌箱 (室 )內(nèi)，以無菌操作方法，用無菌吸管分別注入待保存的各個試管菌種內(nèi)，注入量以淹過斜面 1cm為宜。 然后塞以橡皮膠塞，用蠟封口，直立于試管架上，放入 4℃ 冰箱中或常溫下保藏。此法可保藏 5～ 7年，但最好1～ 2年移植一次。使用時，不必倒去石蠟油，只要用接種針從斜面上挑取小塊菌絲即可 (但要盡量少帶石蠟油 )。余下的母種可繼續(xù)保藏。由于挑出移接的菌絲塊沾有石蠟，故生長微弱，必須轉(zhuǎn)接幾次才能恢復正常。 微生物菌種的保藏 砂土管保藏法 ? 河砂處理 取河砂若干加入鹽酸 10% ，加熱煮沸 30min除去有機機質(zhì)。倒去鹽酸溶液，用自來水沖洗至中性，最后一次用蒸鎦水沖洗，烘干后用 40目篩子過篩，棄去粗顆粒，備用。 ? 土壤處理 取非耕作層不含腐殖質(zhì)的痩黃土或紅土，加自來水浸泡洗滌數(shù)次，直至中性。烘干后碾碎，用 100目篩子過篩，粗顆粒部分丟掉。 ? 砂土混合 處理妥當?shù)暮由芭c土壤按 3： 1的比例摻合 (或根據(jù)需要而用其他比例，甚至可全部作砂或土 )均勻后，裝入10x100mm的小試管或安瓿管中，每管分裝 1g左右，塞上棉塞，進行滅菌 (通常采用間歇滅菌 23次 )，烘干。 微生物菌種的保藏 ? 無菌檢查 每 10支砂土管隨機抽 1支 ， 將砂土倒入肉湯培養(yǎng)基中 ， 30℃ 培養(yǎng) 40h， 若發(fā)現(xiàn)有微生物生長 ， 所有砂土管則需重新滅菌 ， 再作無菌試驗 ， 直至證明無菌后方可使用 。 ? 菌懸液的制備 取生長健壯的新鮮斜面菌種 ， 加入 23ml無菌水 (每 18x180mm 的試管斜面菌種 )， 用接種環(huán)輕輕將菌苔洗下 ， 制成菌懸液 。 ? 分裝樣品 每支砂土管 (注明標記后 )加入 0． 5ml菌懸液(剛剛使砂土潤濕為宜 )， 用接種針拌勻 。 微生物菌種的保藏 ? 干燥 將裝有菌懸液的砂土管放入干燥器內(nèi) ， 干燥器底部盛有干燥劑 。 用真空泵抽干水分后火焰封口 (也可用橡皮塞或棉塞塞住試管口 )。 ? 保存 置 4℃ 冰箱或室溫干燥處 ， 每隔一定的時間進行檢測 。 此法多用于產(chǎn)芽孢的細菌 、 產(chǎn)生孢子的霉菌和放線菌 。 在抗生素工業(yè)生產(chǎn)中應用廣泛 、 效果較好 ， 可保存幾年時間 ， 但對營養(yǎng)細胞效果不佳 。 微生物菌種的保藏 注意事項 實驗操作要嚴格無菌。 需保藏的菌種需是生長健壯的菌種。 各種保藏方法的有效時間不同，時間到了以后要及時的進行菌種活化后再進行菌種保藏。 微生物菌種的保藏 細菌生長曲線的測定 實驗目的 了解細菌生長的特點及測定原理，掌握其生長規(guī) 律，繪制生長曲線。 掌握光電比濁法測量細菌數(shù)量的方法。 細菌生長曲線的測定 實驗原理 將少量細菌接種到一定體積的、適合的新鮮培養(yǎng)基中，在適宜的條件下進行培養(yǎng)，定時測定培養(yǎng)液中的菌量，以菌量作縱坐標，生長時間作橫坐標，繪制的曲線叫生長曲線。它反映了單細胞微生物在一定環(huán)境條件下于液體培養(yǎng)時所表現(xiàn)出的群體生長規(guī)律。依據(jù)其生長速率的不同，一般可把生長曲線分為延緩期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期。這四個時期的長短因菌種的遺傳性、接種量和培養(yǎng)條件的不同而有所改變。因此通過測定微生物的生長曲線，可了解各菌的生長規(guī)律，對于科研和生產(chǎn)都具有重要的指導意義。 細菌生長曲線的測定 測定微生物的數(shù)量有多種不同的方法，可根據(jù)要求和實驗室條件選用。本實驗采用比濁法測定，由于細菌懸液的濃度與光密度（ OD值）成正比，因此可利用分光光度計測定菌懸液的光密度來推知菌液的濃度，并將所測的 OD值與其對應的培養(yǎng)時間作圖，即可繪出該菌在一定條件下的生長曲線，此法快捷、簡便。 細菌生長曲線的測定 試劑和器材 ： 乳酸乳球菌 ： 配方：蛋白胨 10g 酵母粉 5g NaCl 10g 葡萄糖 2g 蒸餾水 1000ml 鐘 ： 752分光光度計、恒溫搖床、無菌試管、無菌吸管、三角瓶、試管。 細菌生長曲線的測定 方法步驟 ?每組用 5ml無菌吸管準確吸取 LB培養(yǎng)基于 1支無菌試管中，作為空白對照，放入冰箱保存。 ?量取 100ml液體培養(yǎng)基于 250ml三角瓶中，用 5ml無菌吸管準確吸取 18小時的乳酸乳球菌培養(yǎng)液于三角瓶中，振蕩，充分搖勻 ?將已接種的培養(yǎng)液用 5ml無菌吸管準確吸取 5ml混合液于 11支試管中。 ?將未接種的培養(yǎng)基試管標上 “ CK”， 11支接種的試管分別標上 0,2,4,6,8,10,12,14,16等小時。 ?將已接種的試管置搖床 37℃ 恒溫培養(yǎng)，每隔一段時間將相應的試管取出，放入冰箱保存。 ?最后一同用分光光度計測定其光密度值，波長選用 600nm ?畫出菌體生長曲線 細菌生長曲線的測定 注意事項 ?取樣時間要平行 ?測菌體光密度要準確 ?確保發(fā)酵液不要染菌 細菌生長曲線的測定 實驗安排 為微生物分離純化做準備 ?配制培養(yǎng)基 ? 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 3000ml ? M17培養(yǎng)基 3000ml ? 查氏培養(yǎng)基 1500ml ? 高氏一號培養(yǎng)基 500ml ? 馬丁氏培養(yǎng)基 500ml ? 包扎玻璃器皿（試管 19支 /組、培養(yǎng)皿 17套 /組、250ml錐形瓶裝 150ml無菌水 1瓶 /組） ?121℃ 20分鐘滅菌 周六實驗安排 微生物分離純化 ? 分離純化土壤中微生物 ? 倒平板 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 7個、 M17培養(yǎng)基 5個、查氏培養(yǎng)基3個、高氏一號培養(yǎng)基 1個、馬丁氏培養(yǎng)基 1個 ? 稀釋菌液 土壤菌旋液稀釋 9個梯度、酸奶稀釋 6個梯度 ? 接種菌液 取土壤稀釋液 106— 、取酸奶稀釋液 102— M17培養(yǎng)基； 103劃線牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板； 和馬丁氏培養(yǎng)基平板。 104— 板。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基倒斜面 2支， M17培養(yǎng)基倒斜面 1支。 周二實驗安排 細菌形態(tài)觀察、為生理生化反應做準備實驗 ? 細菌形態(tài)觀察 取昨天牛肉膏 M17培養(yǎng)基分離出的單菌落制片觀察，后劃斜面于昨天的斜面中 ? 配制生理生化反應培養(yǎng)基 淀粉固體培養(yǎng)基 600ml分裝 2個 500ml錐形瓶、葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基 1000ml分裝 4支試管、醋酸鉛培養(yǎng)基 400ml分裝2支試管、蛋白胨水培養(yǎng)基 800ml分裝 4支試管、葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基 800ml分裝 4支試管、檸檬酸鹽培養(yǎng)基 400ml分裝 2支試管，包扎后 121℃20 分鐘滅菌，包扎培養(yǎng)皿 100套 121℃20 分鐘滅菌。配制查氏培養(yǎng)基 1500ml、高氏一號培養(yǎng)基 500ml121℃20 分鐘滅菌。配制 M17液體培養(yǎng)基 20瓶121℃20 分鐘滅菌 周三實驗安排 酵母形態(tài)觀察、死活細胞鑒定、血球計數(shù)板計數(shù)，細菌生理生化反應實驗接菌，霉菌放線菌插片培養(yǎng) ?酵母形態(tài)觀察，死活細胞鑒定、血球計數(shù)板計數(shù) 挑取馬丁氏培養(yǎng)基分離出的酵母菌形態(tài)觀察，并制作菌液血球計數(shù)板計數(shù)。 ?將分離出的試管中培養(yǎng)的菌種接種細菌細胞生理生化反應培養(yǎng)基中。 37 ℃ 培養(yǎng) 。 ?倒平板 查氏培養(yǎng)基 3個、高氏一號培養(yǎng)基 1個，將分離出的霉菌和放線菌分別劃線并插片。 ?28 ℃ 培養(yǎng)。將分離出的乳酸乳球菌接種到 M17液體培養(yǎng)基中 37 ℃ 震蕩培養(yǎng)。 周四實驗安排 乳鏈菌肽效價測定、生理生化反應觀察結(jié)果、菌種保藏 ? 乳鏈菌肽效價測定 ? 將昨天培養(yǎng)的乳酸乳球菌分裝試管中 4 ℃ 靜止。 ? 配制底層培養(yǎng)基 1000ml、頂層培養(yǎng)基 200ml、培養(yǎng)皿 40套、打孔器、牙簽 121℃20 分鐘滅菌。 ? 滅菌后倒底層平板，冷卻后將 50 ℃ 的頂層培養(yǎng)基 200ml混入 400ul搖至一天的枯草芽孢桿菌菌液后倒頂層培養(yǎng)基。打孔。將昨天培養(yǎng)的乳酸乳球菌分裝試管中 4 ℃ 靜止后的上清用滴管加入孔中， 37 ℃ 正置培養(yǎng)。 ? 菌種保藏 采用沙土管、液體石蠟、甘油保藏，配制液體 LB培養(yǎng)基 20瓶 121℃20 分鐘滅菌。 周五實驗安排 細菌生長曲線測定，霉菌、放線菌形態(tài)觀察 ?細菌生長曲線測定 將分離出的大腸桿菌接種到 LB培養(yǎng)基中37 ℃160 轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)，每隔 2h測 OD600值 ?霉菌、放線菌形態(tài)觀察 周六實驗安排