【正文】 )插入表達載體或整合到染色體后，均能使lac、tac啟動子的轉(zhuǎn)錄受到溫度嚴謹調(diào)控，在較低溫度（30℃）時抑制，在較高溫度（42℃）時開放；（2）用乳糖替代IPTG，但其效率受到多種因素的影響和制約，因此乳糖誘導(dǎo)的有效劑量大大高于IPTG。乳糖本身作為一種碳源可以被大腸桿菌代謝利用，較多的乳糖存在也會導(dǎo)致菌體生理及生長特性變化。乳糖代替IPTG作為誘導(dǎo)劑的研究要與發(fā)酵工藝結(jié)合起來，才能顯示其良好的前景。11.PL和PR表達載體由于菌體中沒有cI基因產(chǎn)物，PL或PR啟動子的高強度直接轉(zhuǎn)錄使其在普通大腸桿菌中相當不穩(wěn)定。如何解決這一問題?答：辦法之一是用溶源化λ噬箘體的大腸桿菌作為PL和PR啟動子表達載體的宿主菌；或是把cI857ts基因組裝在表達載體上，這樣就可以有更大的宿主菌選擇范圍。？答：解決這一問題的辦法之一就是在表達系統(tǒng)中低水平表達T7溶菌酶基因。因為T7溶菌酶除了作用于大腸桿菌細胞壁上的肽聚糖外，還與T7 RNA聚合酶結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄活性。目前T7溶菌酶基因都通過共轉(zhuǎn)化質(zhì)粒導(dǎo)入表達系統(tǒng)，它能明顯降低本底轉(zhuǎn)錄，但對誘導(dǎo)后目標基因的表達水平?jīng)]有明顯影響。13.去除附加的甲硫氨酸有什么方法？答：在表達系統(tǒng)中共表達甲硫氨酸氨肽酶基因；分離純化后在體外用外肽酶處理。14.轉(zhuǎn)化的大腸桿菌為什么不長？答：A）檢查感受態(tài)細胞是否有問題，不管公司的也好自己做的也好，轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物時同時轉(zhuǎn)化一只質(zhì)粒，作為對照。B）連接T的時候,保證連接比例沒有問題。連接時間可以適當延長，但是試劑盒的連接往往效率很高，連接時間不是大問題。C）轉(zhuǎn)化的細節(jié)處理：加培養(yǎng)基復(fù)蘇：搖1h的話，可以多加入一些培養(yǎng)基，此時培養(yǎng)基一定不要加入抗性！搖1h復(fù)蘇，搖速在150rpm先搖30min。D)涂板時來回輕輕涂布，感覺大多數(shù)地方都涂到即可,不要反復(fù)用力涂布,不要把涂布環(huán)或者涂布棒燒的過熱,或者不待冷卻就涂。切記感受態(tài)細胞比較嬌嫩。E）檢查一下瓊脂板是否有問題。F）檢查一下抗生素在配置過程中是否出錯，有沒有加錯。15.如何增加蛋白在大腸桿菌中的表達？答：有以下幾種方法：（1）摸索不同溫度進行表達（2）提高誘導(dǎo)時間（3）改變基因上游構(gòu)建，對目的基因進行密碼子優(yōu)化（4）提高質(zhì)粒穩(wěn)定性（5）插入信號肽16.提高目標蛋白的穩(wěn)定性的措施有哪些？答：主要有：（1）利用蛋白轉(zhuǎn)運系統(tǒng)把目標蛋白最終積累在周質(zhì)空間或分泌到培養(yǎng)基中；（2）采用缺乏某些蛋白水解酶基因的缺陷株作為宿主菌；（3）對分子量較小的目標基因進行融合表達或串聯(lián)聚合表達；（4）共表達能提高特定目標蛋白穩(wěn)定性的輔助因子，如分子伴侶基因；（5）對蛋白質(zhì)序列中的蛋白水解酶敏感區(qū)域和識別位點進行改造；（6）在較低溫度下培養(yǎng)菌體和優(yōu)化發(fā)酵條件。bbsbio20090722 10:01Southern雜交（1）做Southern用雜交袋還是雜交管（瓶）好？答：雜交管好用，首先雜交管不用擔心氣泡問題，而且膜可以均勻雜交，其次雜交管其實也用不了多少雜交液，只需要幾毫升，在雜交爐里旋轉(zhuǎn)就可以保證膜均勻雜交。（2）細菌基因組酶切后的條帶可不可以用非變性聚丙烯酰胺凝膠來分離？然后再通過濕轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，一般要轉(zhuǎn)印多久？%左右的瓊脂糖凝膠來分離的，但是通過傳統(tǒng)的毛細管法轉(zhuǎn)印到膜上比較麻煩，瓊脂糖凝膠上的DNA能通過半干轉(zhuǎn)印儀來轉(zhuǎn)印嗎？答：首先不一定要用非變性聚丙烯酰胺凝膠來分離：Southern雜交目的就是要知道基因組中是否有想要的基因片段，并且可能還要知道此基因片段的位置是否與預(yù)期的一樣，所以酶切基因組并雜交，其雜交條帶的大小是很重要的指標，如果采用非變性聚丙烯酰胺凝膠，雖然大多數(shù)DNA的遷移率與其大小的對數(shù)值成反比，但遷移率也受堿基組成序列的影響，以致大小完全相同的DNA遷移率相差達10%，所以非變性聚丙烯酰胺凝膠不能用來確定DNA的大小。一般采用瓊脂糖凝膠電泳。但是，如果不在意片段的大小，可以聚丙烯酰胺凝膠后采用電轉(zhuǎn)的方法。電轉(zhuǎn)的時間取決于片段的大小，凝膠空隙和外加電場的強度，可參閱電轉(zhuǎn)移的說明書。其次是轉(zhuǎn)移方法：基本上有三種：毛細管轉(zhuǎn)移最常用也很穩(wěn)定。電轉(zhuǎn)移效果不好，必須使用帶電的尼龍膜，溫度可能會過熱等等問題，經(jīng)常是時而轉(zhuǎn)不出來。真空轉(zhuǎn)移效率?擼枰瞧鰲Ｃ腹蘢撲淙宦櫸?，但脫]刑跫那榭魷倫詈糜茫曳淺Ｎ榷?，大小片段都奶d煤芎謾?（3）Southern雜交的時候用什么來做標記比較好呢?除了放射性元素以外。答： 非放射性標記系統(tǒng)主要包括三大類：半抗原類、熒光色素類、酶類。其中半抗原類使用最為廣泛，商品化選擇最多。①半抗原類：主要有生物素(biotin)、地高辛、熒光素、二硝基苯(dinitrophenyl)、雌二醇、香豆素等，前三者使用最為廣泛，且均有商品化試劑盒選用。②熒光色素類：主要包括熒光素、異硫氰酸熒光素、香豆素、德州紅等。③酶標法：以Amersham Pharmacia公司開發(fā)的ECL系統(tǒng)為代表。它是在戊二醛的作用下將辣跟過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酶(AP)與寡棱苷酸探針片斷直接共價相連，此法簡化了檢測步驟，減少了非特異污染的可能。在這些系統(tǒng)中以新的熒光色素類標記物最具潛力。非放射性系統(tǒng)的優(yōu)勢為：(1)安全、無污染、使用及后處理方便；(2)穩(wěn)定性好，標記好的探針可保存一年甚至更久，降低工作強度、批次檢測之間重復(fù)性好，為多樣本或長期檢測帶來極大方便；(3)利用幾種不同的探針標記方法，可一次對同一樣本進行多探針雜交。非放射性標記物發(fā)展方向為靈敏度高、穩(wěn)定性好、實驗周期短、檢測方法簡單、安全。細菌的藍白斑篩選法篩選轉(zhuǎn)化子　（1）藍白斑篩選怎么都是白斑？目的基因900bp，T載體是takara的PMD18－T，加A后與T載體連接。瓊脂平板表面涂40微升2％的X－gal和28微升5％的IPTG，16h后平板上都是白色菌落，一個藍色的也沒有。選了5個菌落，搖過夜，抽提質(zhì)粒，電泳發(fā)現(xiàn)其中四個在2200bp左右有明亮的條帶。但載體就有2800bp左右，連上就應(yīng)該有3700bp，那條帶是什么？答：如果平板上長了幾百個菌，全是白的就可能有問題，16h對常用的克隆用的大腸桿菌來說，因該已經(jīng)顯色了，不過如果菌長得慢，比較小的話，可以在室溫或4度（３７度放久了容易長衛(wèi)星小菌落），繼續(xù)放一段時間，看看會不會有部分變藍。如果就幾個或幾十個菌，白斑居多的可能性會有很大，但基本沒有連一個藍斑都沒有的情況，因為即使Ｔ載體不連接片斷，也有的會長出來（僅用Ｔ載體加連接酶后轉(zhuǎn)化，涂板，能長幾百個菌，也只是有幾個或是幾個是白的，說明不插入片斷并不一定都是藍的），這可能是由于Ｔ載體的質(zhì)量也不是絕對的好，可能有部分發(fā)生了末端的降解，或者加Ｔ的時候不完美。另外，形成白斑的可能有兩種：①插入片斷破壞了半乳糖苷酶基因的讀碼框；②插入片斷雖然不破壞讀碼框，但插入片斷基因編碼氨基酸阻礙了半乳糖苷酶正確構(gòu)象的形成?！?。若是帶了marker，才進行比較的，新提的質(zhì)粒中一般占主要，亮度較大，在最前面。接著會有第二條帶，是線性的，第三條帶，是有缺口的。質(zhì)粒直接比大小，與marker比，不好反應(yīng)出其真實的大小?？梢赃@樣比較：①比較提的質(zhì)粒的超螺旋帶或線性的或缺口的。先從中找出較大的，大的可能性比較大；②質(zhì)粒單酶切后，與marker比大小，或用質(zhì)粒三條帶中的線性的與marker比大??；③直接用酶切，看是否放出與你目的基因片斷大小一致的片斷。takara的PMD18－T載體假陽性也就是白斑往往比較多，所以藍白斑只是參考作用，可以直接挑克隆篩選。一次挑20－40個克隆，然后直接取上清1－2ul作為模板進行PCR鑒定（注意要用載體上的通用引物進行鑒定），這樣就不用擴大培養(yǎng)抽質(zhì)粒，節(jié)約時間和試劑。其實18T本來作藍白斑篩選效果就不太好,可以改用19T或者20T，效果可能好點。(2)為什么藍白斑篩選會出現(xiàn)假陰性？答：此類載體攜帶lacZ’基因，它編碼β半乳糖苷酶的N末端（α肽），并且處于可被安慰誘導(dǎo)物IPTG（異丙基硫代半乳糖苷，與乳糖結(jié)構(gòu)類似但不能被β半乳糖苷酶降解）誘導(dǎo)的啟動子調(diào)控之下。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主菌為LacZ△M15 基因型（含有編碼N末端缺陷型的β半乳糖苷酶多肽的基因）。未重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌后，在IPTG 的誘導(dǎo)下，質(zhì)粒與基因組分別表達缺陷但可以相互補償?shù)膬蓚€肽（即α互補），形成了有功能的β半乳糖苷酶，該酶能把培養(yǎng)基中無色的Xgal（5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷）底物分解成半乳糖和深藍色的5溴4氯靛藍。然而當外源DNA 插入質(zhì)粒位于α肽編碼序列中的多克隆位點時，由于破壞了α肽的閱讀框架，因而不能表達出與宿主菌基因組表達的缺陷型β半乳糖苷酶多肽發(fā)生α互補。由于沒有β半乳糖苷酶的酶解作用，致使重組菌形成白色菌落。由此，可以借助藍白斑很容易篩選出重組子。不過實際操作中發(fā)現(xiàn)當插入小片段時，重組子也有形成淺藍斑的情況。即藍色菌斑也有可能含外源基因。據(jù)最新報道，大概有30%的假陰性。（3）做藍白斑篩選重組子的時候，平板在37℃培養(yǎng)了16個小時，放入4℃下充分顯色3個小時，仍然只有白斑而沒有藍斑。在挑了菌落之后放入4℃冰箱內(nèi)12個小時仍然沒有藍斑。但是再將其置入37℃條件下12個小時就出現(xiàn)了藍白斑？答：原因有可能以下幾個：首先可能是連接效率很高，片段全插進去了，還有可能是在AT克隆時插入了很多非特意性的片段，尤其是小的非特意性片段；這兩個情況幾乎看不到藍菌。另外底物有問題，用IPTG/Xgal或其他的，要注意加入的量，過大和過小都不行，另外這兩個配制的方法也不能錯。還有插入的片段很大，因為大片段插入后細菌生長的速度很慢，而且又是單拷貝的，所以就培養(yǎng)24小時才能明顯看出顏色。（4）藍白篩選在實驗操作過程中會發(fā)現(xiàn)有淺藍色重組子的出現(xiàn)，怎么解釋這種現(xiàn)象？答：如果培養(yǎng)時間過長，白斑也有可能變藍的。所以一般48小時就可以了。建議挑白斑搖菌后，再做一次篩選。外源基因在大腸桿菌中的表達（1）大腸桿菌構(gòu)建基因工程菌，怎樣突破專利中的代謝途徑？要構(gòu)建大腸桿菌構(gòu)建基因工程菌，但國外已經(jīng)幾乎把通向目標產(chǎn)物的所有途徑和相應(yīng)的酶基因申請專利。能夠利用已有途徑，對其中的酶進行突變，這樣能突破專利嗎？答：一些基因是可以的，但是突變后的性質(zhì)要發(fā)生很大改變，或者在序列上發(fā)生很大的差異，同源性一般要低于80％。國外的專利有些很霸道的，連可能的突變位置都申請了專利保護，這類基因很難突破專利的。（2）鄰近基因的表達相互是否有聯(lián)系??？比如幾個基因排列都處于相同的染色體區(qū)域，那這幾個基因的表達調(diào)控有否影響？答：不一定。在原核生物中，一個調(diào)控單位稱操縱子（如乳糖操縱子），乳糖操縱子包括調(diào)節(jié)基因、啟動基因、操縱基因和結(jié)構(gòu)基因，這四個相鄰基因間的表達就相互影響，其中結(jié)構(gòu)基因又包括表達三中蛋白的lacZ Y A三種基因，他們雖相鄰，但相互之間沒影響，共同受調(diào)節(jié)基因的表達影響。在相同染色體區(qū)域，不同操縱子之間一般不會相互影響。在真核生物中即使是染色體在同一區(qū)域的基因之間表達也可能不會相互影響。真核生物基因由外顯子和內(nèi)含子構(gòu)成，比方說用ABCDEF表示一段DNA，一個基因表達出來可能是ACD序列蛋白，另一個基因表達出來可能是BCE，在這段染色體中這兩個基因不僅是相鄰，還有部分重疊，他們之間的表達也大多不會影響，只不過是他們的表達受控于不同的調(diào)控序列或不同的啟動子。（3）什么類型的真核基因不適宜在大腸桿菌中表達？目前知道一些跨膜蛋白因結(jié)構(gòu)太復(fù)雜，不能在大腸桿菌中表達，不知道一些糖蛋白基因能否在大腸桿菌中表達？答：在大腸桿菌中表達的蛋白不能夠被糖基化，所以如果糖基對于該糖基化蛋白的活性很重要的化，就不能夠用大腸桿菌表達。寧可累死在路上，也不能閑死在家里！寧可去碰壁，也不能面壁。是狼就要練好牙，是羊就要練好腿。什么是奮斗？奮斗就是每天很難，可一年一年卻越來越容易。不奮斗就是每天都很容易，可一年一年越來越難。能干的人，不在情緒上計較，只在做事上認真；無能的人！不在做事上認真，只在情緒上計較。拼一個春夏秋冬！贏一個無悔人生！早安！—————獻給所有努力的人.學(xué)習(xí)參考