【正文】 國標(biāo)碼：□□□□□□標(biāo)本編號標(biāo)本類型采集日期采集人檢測結(jié)果型別檢測日期檢測人核酸檢測病毒分離序列測定注：對于核酸檢測中的序列測定，報(bào)送結(jié)果中應(yīng)包括原始測序彩圖文件和序列文件的電子版拷貝。填表時(shí)間：年月日 單位（蓋章）：； 填表人：訊鎬謾蟈賀綜樞輒鎖廩諭銥瘞。附表 疑似登革熱病例送檢表（臨床）送檢單編號：疑似登革熱病例送檢單送檢或住院號： 檢驗(yàn)室編號：姓名： 性別： 年齡：地址：入院日期： 發(fā)病日期：臨床診斷：入院主訴：臨床表現(xiàn)：. 發(fā)熱：℃（最高）持續(xù)：天. 頭痛：（）有；（）無. 關(guān)節(jié)、肌肉痛：（）有；（）無. 束臂試驗(yàn)：，皮膚淤點(diǎn)： 鼻衄： 嘔血： 其它出血：. 血壓：. 脈搏：分鐘流行病學(xué)史：臨床化驗(yàn)：血小板： （起病后第天）紅細(xì)胞壓積：血標(biāo)本：采血日期：（）入院時(shí) （）出院時(shí) （）恢復(fù)期檢測項(xiàng)目：（）登革熱病毒分離 （）登革熱抗體檢測送檢醫(yī)師： 單位：送檢日期：注：標(biāo)本管上必須注明相應(yīng)的姓名、送檢編號或住院號。附件 免疫熒光法（）檢測抗體試驗(yàn)材料：（）～型抗原片：標(biāo)準(zhǔn)毒株感染或細(xì)胞制備，低溫干燥保存；（）對照：登革熱患者恢復(fù)期血清（陽性對照），非登革熱患者血清陰性對照)；（）羊抗人（或兔抗人）熒光素標(biāo)記抗體；（）常用稀釋液：～、伊文思蘭等；（）熒光顯微鏡。檢測步驟：（）用， 稀釋待檢血清，從開始做倍連續(xù)稀釋至需要的稀釋度。兒躉讀閌軒鯀擬釔標(biāo)藪疇礎(chǔ)處。（）取出抗原片，用蒸餾水漂洗后，冷風(fēng)吹干。（）用加樣器依次從高稀釋度到低稀釋度逐個(gè)加入已稀釋的待檢血清，加入量以覆蓋細(xì)胞抗原面為準(zhǔn)（若為雙份血清，最好上排為急性期血清，下排為恢復(fù)期血清），在℃水浴箱濕盒孵育分鐘（每次試驗(yàn)設(shè)陽、陰性對照）。繅藺詞嗇適籃異銅鑑驃噴麗頡。（）用震蕩洗滌次，每次分鐘，再用蒸餾水洗滌次脫鹽，冷風(fēng)吹干。（）用含：萬的伊文思蘭按工作濃度稀釋熒光結(jié)合物，滴加各孔（以覆蓋細(xì)胞抗原面為準(zhǔn)），在 ℃水浴箱濕盒孵育分鐘，然后同（）洗滌、漂洗、吹干。鮒簡觸癘鈄餒嬋鏘戶潑閡諏誹。（）熒光顯微鏡觀察結(jié)果。結(jié)果判斷：細(xì)胞內(nèi)病毒特異性熒光為黃綠色顆粒，分布在感染細(xì)胞的胞漿內(nèi)。根據(jù)特異性熒光顆粒多少、熒光亮度、陽性細(xì)胞在細(xì)胞總數(shù)中所占比例，可將免疫熒光反應(yīng)大致區(qū)分為～個(gè)“”。瞇毆蠐謝銀癩嘮閣蹺贗襝攖癰。檢測抗體滴度時(shí)，以能觀察到明顯特異性熒光反應(yīng)（“”）最高血清稀釋度的倒數(shù)表示。意義：陽性結(jié)果，表明曾受到感染，：有診斷參考意義；恢復(fù)期血清抗體滴度比急性期抗體滴度有倍或倍以上升高則可確診。附件 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（）檢測單份和或雙份血清抗體試驗(yàn)材料：（）抗原：陽性抗原：采用細(xì)胞感染登革病毒培養(yǎng)物為陽性抗原。陰性抗原：未接種病毒的正常細(xì)胞為陰性抗原對照。（）辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人抗體；（）緩沖液：包被液：碳酸緩沖液；稀釋液： （含脫脂奶）洗滌液： －（％吐溫－）；（）顯色液：液（）終止液：（）酶標(biāo)板、酶標(biāo)儀。檢測步驟：（）用包被液按工作濃度稀釋抗原，μ孔，℃過夜；（）棄去包被液，用重復(fù)洗滌～次，甩干；（）將待檢血清用稀釋液從：開始作或倍連續(xù)稀釋，加入抗原孔，μ孔，同時(shí)設(shè)陰、陽性對照，℃水浴小時(shí)；閔屢螢馳鑷雋劍頌崗鳳測際塤。（）棄去血清，用洗滌液洗滌～次；（）加酶結(jié)合物，用稀釋液按工作濃度稀釋，μ孔，℃水浴小時(shí)；（）棄去酶標(biāo)抗體，用洗滌液洗滌次，甩干；（）加顯色液：于各反應(yīng)孔內(nèi)加液各一滴，℃，避光～分鐘；（）加終止液于每反應(yīng)孔，μ 孔。結(jié)果判斷：于（）陽性對照孔值陰性對照孔值，即≥，對照成立；若待檢血清孔值與陰性對照孔比值≥，則標(biāo)本為登革熱抗體陽性，反之陰性。（陰性對照孔值小于按記，若大于按實(shí)際數(shù)值計(jì)算）檁傷葦開閾燈傘饉諧糧茲繃頎。意義：陽性結(jié)果，表明曾受到感染，：有診斷參考意義；恢復(fù)期血清抗體滴度比急性期抗體滴度有倍或倍以上升高則可確診。附件 捕捉法（）檢測登革熱抗體試驗(yàn)材料：（）抗原：陽性抗原：采用細(xì)胞感染登革病毒培養(yǎng)物為陽性抗原。陰性抗原：未接種病毒的正常細(xì)胞為陰性抗原對照。（）抗人（μ鏈）單克隆抗體或多克隆抗體；（）登革病毒陽性、陰性對照血清；（）辣根過氧化物酶標(biāo)記登革病毒單克隆抗體；（）緩沖液：洗滌液： －（％吐溫－）；稀釋液： （％牛血清）；封閉液： 碳酸緩沖液（％牛血清白蛋白）；（）顯色液：液（）終止液：（）酶標(biāo)板、酶標(biāo)儀。檢測步驟：（）用稀釋液按效價(jià)稀釋抗人μ鏈單克隆抗體，μ孔，加蓋，℃過夜；（）棄去抗人μ鏈，用洗滌液重復(fù)洗次，甩干，加封閉液，μ孔，置℃水浴孵育小時(shí)；（）棄封閉液，用洗滌液重復(fù)洗次，甩干。（）將待檢血清用稀釋液從：開始作或倍連續(xù)稀釋，加入酶標(biāo)板孔中，μ孔，同時(shí)加入已：稀釋的陽性血清、陰性血清對照各孔，μ孔，置℃水浴孵育小時(shí)；鄭餼腸絆頎鎦鷓鮞嚶錳鉻廄說。（）棄去血清，用洗滌液重復(fù)洗次，甩干，分別加個(gè)型抗原及陰性抗原對照，μ孔，℃過夜；棄鈾縫遷馀氣鰷鸞覲廩脫轉(zhuǎn)畬。（）棄抗原，用洗滌液重復(fù)洗次，甩干，加用稀釋液稀釋至工作濃度的相應(yīng)的登革熱酶標(biāo)單克隆抗體，正?？乖觽€(gè)型混合的酶標(biāo)單克隆抗體，μ孔，℃水浴小時(shí)；調(diào)誶續(xù)鷚髏鋮饅喪劉藪顯澮壚。（）棄去標(biāo)記物，用洗滌液重復(fù)洗次，甩干，于各反應(yīng)孔內(nèi)加液各一滴，℃，避光～分鐘；（）加終止液于每反應(yīng)孔，一滴孔。結(jié)果判斷：（）目測方法：陽性對照孔呈明顯藍(lán)色，陰性對照孔呈無色，對照成立；若待檢血清孔呈明顯淡藍(lán)色或深藍(lán)色（），則標(biāo)本為登革熱抗體陽性，反之陰性。厲聳紐楊鱔晉頇兗蓽驃鶚騅頇。（）酶聯(lián)免疫檢測儀檢測：于（）陽性對照孔值陰性對照孔值，即≥，對照成立；若待檢血清孔值與陰性對照孔比值≥，則標(biāo)本為登革熱抗體陽性，反之陰性。（陰性對照孔值小于按記，若大于按實(shí)際數(shù)值計(jì)算）苧璦籮藶黃邏閂巹東澤達(dá)藥誣。意義：陽性結(jié)果，表明患者新近感染，用于登革熱早期診斷。附件 （或）細(xì)胞分離登革熱病毒標(biāo)本：（）患者血清：無菌采集發(fā)病后日內(nèi)登革患者靜脈血，分離血清，接種細(xì)胞培養(yǎng)；不能及時(shí)接種細(xì)胞者可置℃保存。污染的血清要加雙抗（青霉素、鏈霉素，終濃度各），℃小時(shí)處理后接種細(xì)胞。鴿攝禱鋅儀憚銼嚕緡贊綁塵瑤。（）尸檢材料：腦、肝等。（）蚊：采集吸過血的伊蚊或其它可疑媒介蚊，用（％）葡萄糖液喂養(yǎng)，至胃血完全消化后置℃保存，死后按蚊種及捕獲地點(diǎn)分組，～只組，生理鹽水沖洗數(shù)次后，用研磨器研碎，每組加 ’液，轉(zhuǎn)分鐘離心分鐘，取上清加雙抗（青霉素、鏈霉素，終濃度各），℃過夜，備用。簞嗇癲剴凈趕鉤嬙鱷鳧徑鉍塊。病毒分離：將培養(yǎng)好的單層細(xì)胞上清棄掉，用’液洗滌遍，接種用’液稀釋成的患者血清或組織懸液或蚊懸液。細(xì)胞在℃吸附小時(shí)， 細(xì)胞在℃吸附小時(shí)，補(bǔ)加維持液，細(xì)胞在℃培養(yǎng)，細(xì)胞在℃培養(yǎng)。第二天開始觀察細(xì)胞病變情況。一般細(xì)胞天左右出現(xiàn)病變，細(xì)胞需要在℃培養(yǎng)天。如果沒有細(xì)胞病變，則盲傳代（每次取細(xì)胞懸液）接種細(xì)胞傳代。按附件進(jìn)行鑒定。頑鷙瑪濱廈峴轆庫糞糧驪癬韌。附件 乳鼠分離登革熱病毒標(biāo)本：同附件。病毒分離：（）每一檢材接種一窩～日齡乳鼠，腦內(nèi)接種只。接種后小時(shí)內(nèi)死亡者按非特異性死亡處理，棄去。漬閫熾訣團(tuán)諳賡戰(zhàn)餛錳貨齏詢。（）存活者觀察天，若仍未發(fā)病，則解剖其中只，取腦，用肉湯制成％懸液，盲傳一窩～日齡乳鼠，存活鼠和盲傳鼠均觀察到第周，未發(fā)病為陰性結(jié)果；鐸輜澠頂嫻塊謂斕痹廩矯詼現(xiàn)。（）在觀察期內(nèi)發(fā)?。ɑ顒?dòng)力降低、站立不穩(wěn)、肢體抽搐、不全麻痹等癥狀）者，解剖，取半邊腦，按盲傳法制成％懸液，接種一窩～日齡乳鼠，并作無菌試驗(yàn)；另半邊腦置（）甘油緩沖液中低溫保存。無菌試驗(yàn)陰性而重復(fù)以上癥狀者作為可以毒種傳代、保存，并按附件進(jìn)行鑒定。搶觀淚婭師謳論櫚陣蘚塹挾圇。附件 免疫熒光法檢測抗原材料：（）細(xì)胞抗原片的制備：出現(xiàn)“”細(xì)胞病變的細(xì)胞或細(xì)胞倒去維持液（若盲傳無細(xì)胞病變出現(xiàn)，仍然按此方法制備），用 洗滌次，加用滴管把細(xì)胞從管壁上吹下，吹散，轉(zhuǎn)分鐘離心分鐘，棄去，沉渣用吹散，滴加在抗原片上，吹干，冷丙酮固定分鐘，沖洗次，蒸餾水漂洗次，吹干，℃保存?zhèn)溆茫毁\組櫻種愨單蝕渾潷騾雛閩霽。（）腦、肝組織片：冷凍切片機(jī)切片，吹干，冷丙酮固定分鐘，沖洗次，蒸餾水漂洗次，吹干，℃保存?zhèn)溆?；圓漣檸賡搗蕷艫燁錘澤謳結(jié)誠。（）熒光標(biāo)記單克隆抗體；（）熒光顯微鏡。方法：（）制備的抗原片或組織片，吹干，按順序滴加個(gè)型的熒光標(biāo)記單克隆抗體，孔型，對照孔（加），置濕盒內(nèi)℃水浴分鐘；蟄彎擼鯁棖佇緡癟槧贊瀅勁豬。（）取出，用沖洗次，蒸餾水漂洗次，吹干；（）熒光顯微鏡觀察結(jié)果。結(jié)果判斷：特異性免疫熒光呈黃綠色顆粒，分布在胞漿中，正常組織細(xì)胞呈橙紅色或暗紅。意義：從病人血清、組織或蚊媒中分離出或查到抗原，可確診感染和病毒型別。附件 檢測基因及分型材料：（）附件和分離的（）引物：（供參考）引物序列（’～’）靶序列（基因）片段（）～通用引物＋)—)型特異性引物＋)—)＋)—)＋)—)＋)—)方法：（）病毒的提?。翰捎冒凑f明提取，制備模板；（）逆轉(zhuǎn)錄、合成：采用或逆轉(zhuǎn)錄酶，按說明書進(jìn)行；（）擴(kuò)增：反應(yīng)條件為℃預(yù)變性分鐘，℃秒、℃秒、℃秒、擴(kuò)增～個(gè)循環(huán)，℃延伸分鐘。義淨(jìng)擁捫毆脅紙窺鈑鳧剝贛噓。（）擴(kuò)增產(chǎn)物用～％瓊脂糖凝膠電泳鑒定。若條帶的分子量與預(yù)期片段大小相同，則表明為特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。綏驊懸縉澀鷂禍紳撻糧錛湯隨。必要時(shí)，可進(jìn)行：（）片段的回收和核苷酸序列測定：切下特異分子量條帶，用凝膠回收試劑盒回收（按其說明書進(jìn)行），自動(dòng)測序儀測序。饅鎖開鑰燜緒玨編軻錙薈馴譯。意義：擴(kuò)增到特異性條帶可確診并明確其型別，序列測定還可以對的變異情況進(jìn)行研