【正文】 特征。銅綠假單胞菌在此培養(yǎng)基上生長良好，菌落扁平，邊緣不整，光滑濕潤，呈灰白色，菌落周圍培養(yǎng)基常擴散有水溶性色素。此培養(yǎng)基選擇性強，大腸桿菌不能生長，革蘭氏陽性菌生長較差。在缺乏十六烷三甲基溴化銨瓊脂時也可用乙酰胺培養(yǎng)基進行分離，從培養(yǎng)液的薄菌膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種于乙酰胺瓊脂平板，置（36士l）℃ 培養(yǎng)（18—24 ) h ，觀察菌落特征。銅綠假單胞菌在此培養(yǎng)基上生長良好，菌落扁平，邊緣不整，菌落周圍培養(yǎng)基略帶粉紅色，其他菌不生長。 取可疑菌落涂片作革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性菌者應(yīng)進行下列試驗： 氧化酶試驗：取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內(nèi)，用無菌玻璃棒挑取可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的l％二甲基對苯二胺試液，（15—30 ) s 內(nèi)出現(xiàn)粉紅色或紫紅色，為氧化酶試驗陽性，不變色者為陰性。 綠膿菌素試驗：取2—3個可疑菌落，分別接種在綠膿菌素測定用培養(yǎng)基（ PDP ）斜面， ( 36 士 l ) ℃ 培養(yǎng)（ 20 — 24 ) h ，加入氯仿（三氯甲烷）（3—5 ) ml ，充分振蕩使培養(yǎng)物中可能存在的綠膿菌素溶解于氯仿液內(nèi)，待氯仿（三氯甲烷）提取液呈藍色時，用吸管將氯仿移到另一試管中并加入 1mol / l 的鹽酸 1ml ，振蕩后靜置片刻。如上層出現(xiàn)粉紅色或紫紅色即為陽性，表示被檢物中有綠膿菌素存在。 硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗：挑取被檢菌落純培養(yǎng)物接種在硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中，置（36士l）℃ 培養(yǎng)24h ，硝酸鹽胨水培養(yǎng)基的小倒管中有氣體者即為陽性。表明該菌能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮氣。 明膠液化試驗：取可疑菌落純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi)，置（36士1）℃ 培養(yǎng) 24h，取出放于（4—10 ）℃ 冰箱30min ，如仍呈溶解狀液態(tài)為陽性，凝固不溶者為陰性。 42 ℃ 生長試驗：取可疑培養(yǎng)物，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，置（41—42 ）℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（24一48 ) h ，有綠膿桿菌生長為陽性。 C . 1 . 2 結(jié)果報告 被檢樣品經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后，證實為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶及綠膿桿菌試驗為陽性者，即可報告為被檢樣品中檢出綠膿桿菌。當(dāng)綠膿菌素試驗為陰性時，但液化明膠試驗、硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗和42 ℃生長試驗三者皆為陽性時，仍可報告被檢樣品中檢出綠膿桿菌。 C . 2 金黃色葡萄球菌檢測方法 C . 2 . 1 操作步驟 以無菌（100 級）操作，取 l : 10 稀釋液 5ml ，加入到 50mLSCDLP 培養(yǎng)液中，充分混勻，置（36士l ) ℃培養(yǎng)24h 。 自上述增菌液中取1—2 接種環(huán)，劃線接種在 Baird Parker 氏培養(yǎng)基，如無此培養(yǎng)基，也可劃線接種在血瓊脂培養(yǎng)基上，置（36士1）℃ 培養(yǎng)（24一48 ) h 。在血瓊脂平板上該菌落呈金黃色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈。在Baird Parker 氏培養(yǎng)基上為圓形，光滑，濕潤，菌落直徑為（2—3 )mm ，顏色呈灰色至黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明帶。 染色鏡檢：挑取典型菌落，涂片作革蘭氏染色鏡檢，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列成葡萄狀，無芽孢與夾膜，直徑為（0 . 5—1 . 0）181。m。鏡檢符合上述情況，應(yīng)進行下列試驗： 甘露醇發(fā)酵試驗：取上述菌落接種甘露醇培養(yǎng)液，置（36士l）℃ 培養(yǎng) 24h ，發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸者為陽性。 血漿凝固酶試驗： 波片法：取清潔干燥載玻片，一端滴加一滴生理鹽水，另一端滴加一滴兔血漿，挑取菌落分別與生理鹽水和血漿充分研磨混合，血漿與菌苔混懸液在5min 內(nèi)出現(xiàn)團塊或顆粒狀凝塊時，而鹽水滴仍呈均勻混濁無凝固現(xiàn)象為陽性，如兩者均無凝固現(xiàn)象為陰性。凡玻片試驗呈陰性反應(yīng)或鹽水滴與血漿均有凝固現(xiàn)象，再進行試管凝固酶試驗。 試管法：吸取1：4 新鮮血漿0 .5ml ，放入滅菌小試管中，再加入待檢菌24h 肉湯培養(yǎng)物0 .5ml ?；靹颍牛?6士1）℃ 培養(yǎng)箱或水浴中，每30min觀察一次，24h之內(nèi)呈現(xiàn)凝塊即為陽性。同時以已知血漿凝固酶陽性和陰性菌株肉湯培養(yǎng)物各0 .5ml 作為陽性與陰性對照。 C . 2 . 2 結(jié)果報告 凡在瓊脂平板上有可疑菌落生長，鏡檢為革蘭氏陽性葡萄球菌，并能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸，血漿凝固酶試驗為陽性者，可報告被檢樣品檢出金黃色葡萄球菌。 C . 3 溶血性鏈球菌檢測方法 C . 3 . 1 操作步驟 以無菌（ 100 級）操作，取 1 : 10 稀釋液 5ml 加入到50ml葡萄糖肉湯中，置于（36 士 l ）℃ 培養(yǎng) 24h 。將培養(yǎng)物劃線接種于血瓊脂平板，( 36士1）℃培養(yǎng)24h 觀察菌落特征。溶血性鏈球菌在血平板上為灰白色，半透明或不透明，針尖狀突起，表面光滑，邊緣整齊，周圍有無色透明溶血圈。 染色鏡檢：挑取典型菌落作涂片革蘭氏染色鏡檢，應(yīng)為革蘭氏陽性，呈鏈狀排列的球菌。鏡檢符合上述情況，應(yīng)進行下列試驗： 鏈激酶試驗：吸取草酸鉀血漿 ( 0 . 01g 草酸鉀加5ml兔血漿混勻，經(jīng)離心沉淀，吸取上清液）， 滅菌生理鹽水，混勻后再加入待檢菌 24h 肉湯培養(yǎng)物0 .％氯化鈣0 .25ml , 混勻，放（36士l）℃ 水浴中，2min 觀察一次（一般 10min 內(nèi)可凝固），待血漿凝固后繼續(xù)觀察并記錄熔化時間。如 2h 內(nèi)不熔化，繼續(xù)放置 24h 觀察，如凝塊全部熔化為陽性，24h仍不熔化為陰性。 桿菌肽敏感試驗：將被檢菌落液涂于血平板上，同時以己知陽性菌株作對照，在（36士2）℃ 下放置（18—24 ) h ，有抑菌帶者為陽性。 C . 3 . 1 結(jié)果報告 鏡檢革蘭氏陽性鏈狀排列球菌，血平板上呈現(xiàn)溶血圈，鏈激酶和桿菌肽試驗陽性，可報告被檢樣品檢出溶血性鏈球菌。附錄 D （規(guī)范性附錄） 人體掉落物檢驗方法D . 1 原理 以人眼感觀檢測樣品上是否有毛發(fā)、皮屑、體液、污漬等。 D. 2 試驗條件 檢測人員應(yīng)先洗臉、洗手，并將頭發(fā)、手、臂等密封起來，以防自身污染影響檢測結(jié)果。D. 3 樣品毛巾類用品、服裝等可以是擺放好待用的，也可以是擺放前成包的；床上用品應(yīng)該是擺放好待用的。D. 4 方法現(xiàn)場以人眼感觀檢驗為主，需要時可輔以（l—2）倍的放大鏡、尖嘴鑷子檢測是否有毛發(fā)、皮屑、體液、污漬等，檢測到的物質(zhì)應(yīng)收集、密封保存。附錄 E （資料性附錄） 培養(yǎng)基與試劑制備 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基成分：蛋白胨 牛肉膏 氯化鈉 瓊脂 15g—20g蒸餾水 I000ml 制法：除瓊脂外其他成分溶解于蒸餾水中，—，加入瓊脂，加熱溶解，分裝試管，121 ℃ 高壓滅菌 20min 后備用。 乳糖膽鹽發(fā)酵管成分：蛋白胨 豬膽鹽（或牛、羊膽鹽） 乳糖 ％溴甲酚紫水溶液 25ml 蒸餾水 加至1000ml 制法：將蛋白胨、膽鹽及乳糖溶于水中，加入指示劑，分裝每管 50ml ，并放入一個小倒管， 115℃ 高壓滅菌15min后備用。 乳糖發(fā)酵管成分：蛋白胨 乳糖 0 . 04 ％溴甲酚紫水溶液 25 ml蒸餾水 加至1000ml 制法：將蛋白胨及乳糖溶于水中， ，加入指示劑，分裝每管 10ml ，并放入一個小倒管， 115 ℃高壓滅菌15min后備用。 （EMB )成分：蛋白胨 乳糖 磷酸氫二鉀 瓊脂 15g 一 20g2 ％伊紅 Y溶液 20ml ％美藍溶液 10ml 蒸餾水 加至 1000ml 制法：將蛋白胨、磷酸鹽和瓊脂溶解于蒸餾水中，分裝于燒瓶內(nèi)，121 ℃ 高壓滅菌 15min 備用，臨用時并加熱溶化瓊脂加入乳糖（過濾滅菌），冷至 55 ℃ ，加入伊紅和美藍溶液搖勻，傾注平板。 液體培養(yǎng)基成分：酪蛋白胨 17 . 0g大豆蛋白胨 3 . 0g 氯化鈉 5 . 0g 磷酸氫二鉀 2 . 5g葡萄糖 2 . 5g卵磷脂 1 . 0g吐溫 80 7 . 0g蒸餾水 1000ml 制法：將各種成分混合（如無酪蛋白胨和大豆蛋白胨也可用日本多價胨代替），加熱溶解，調(diào)pH — ，分裝， 121 ℃ 高壓滅菌 20min ，搖勻，避免吐溫80沉于底部，冷至 25 ℃ 后使用。成分：牛肉膏 3 . 0g 蛋白胨 氯化鈉 5 . 0g十六烷三甲溴銨 15g —20g 蒸餾水 1000ml 制法：除瓊脂外，上述各成分混合加熱溶解，調(diào)pH 至 一 ，然后加入瓊脂， 115℃ 高壓滅菌 20min ，冷至 55 ℃ 左右，傾注平皿。 乙酰胺培養(yǎng)基成分：乙酰胺 氯化鈉 無水磷酸氫二鉀 無水磷酸二氫鉀 硫酸鎂（ MgSO 4? 7H2O ) 酚紅 瓊脂 15g一 20g蒸餾水 1000ml 制法：除瓊脂和酚紅外，將其他成分加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)pH 至 —，然后加入瓊脂和酚紅，121 ℃ 高壓滅菌 20min 后，制成平板備用。 綠膿菌素測定用培養(yǎng)基斜面成分：蛋白胨 氯化鎂 1 . 4g硫酸鉀 10 . 0g瓊脂 15g—20g甘油（化學(xué)純） 蒸餾水 加至1000ml 制法：將蛋白胨、氯化鎂和硫酸鉀加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)pH ，加入瓊脂和甘油，加熱溶解，分裝試管，l15 ℃高壓滅菌20min ，制成斜面?zhèn)溆谩?明膠培養(yǎng)基成分：牛肉膏 蛋白胨 明膠 120g 蒸餾水 1000ml 制法：各成分加入蒸餾水中浸泡20min ，加熱攪拌溶解，調(diào)pH , 5ml分裝于試管中， 115 ℃高壓滅菌20min ，直立制成高層備用。 硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基成分：蛋白胨 酵母浸膏 硝酸鉀 亞硝酸鈉 蒸餾水 1000ml 制法：將蛋白胨與酵母浸膏加到蒸餾水中，加熱溶解，煮沸過濾后補足液量，加入硝酸鉀和亞硝酸鈉溶解均勻，分裝到加有小倒管的試管中，115 ℃高壓滅菌20min 備用。 Baird Parker 培養(yǎng)基成分：胰蛋白胨 牛肉膏 酵母浸膏 丙酮酸鈉 甘氨酸 氯化鋰（ LiC1 ? 6HzO ) 瓊脂 20g蒸餾水 1000ml 增菌劑的配制： 30% 卵黃鹽水50ml 與除菌過濾的1％亞碲酸鉀溶液10ml 混合，保存于冰箱內(nèi)備用。 制法：將各成分加到蒸餾水中，加熱煮沸完全溶解，冷至25 ℃。 分裝每瓶95ml , 121 ℃ 高壓滅菌20min 后備用。臨用時加熱溶化瓊脂，每95ml加入預(yù)熱至50 ℃ 的卵黃亞碲酸鉀增菌劑 5ml ，搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的，使用前在冰箱儲存不得超過18h。 血瓊脂培養(yǎng)基成分：營養(yǎng)瓊脂 100ml 脫纖維羊血（或兔血） 10ml 制法：將滅菌后的營養(yǎng)瓊脂加熱溶化，涼至55 ℃ 左右，用無菌方法將10ml脫纖維血加入后搖勻，傾注平皿置冰箱備用。 甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基成分：蛋白胨 牛肉膏 氯化鈉 甘露醇 ％溴麝香草酚藍溶液 12ml 蒸餾水 1000ml 制法：將蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏加到蒸餾水中，加熱溶解，加入甘露醇和溴麝香草酚藍混勻后，分裝試管，115℃高壓滅菌20min備用。 葡萄糖肉湯成分：蛋白胨 牛肉膏 氯化鈉 葡萄糖 蒸餾水 1000ml 制法：上述成分溶于蒸餾水中，調(diào)pH 至 — ，加熱溶解，分裝試管，121℃高壓滅菌15min后備用。 兔血槳 制法：％檸檬酸鈉1份，兔全血4份，混勻靜置，3000r / min 離心5min ，取上清，棄血球。 沙堡氏瓊脂培養(yǎng)基成分：蛋白胨 葡萄糖 瓊脂 15g —20g蒸餾水 1000ml 制法：用700ml 蒸餾水將瓊脂溶解，300ml蒸餾水將葡萄糖與蛋白胨溶解，混合上述兩部分，搖勻后分裝，l15℃高壓滅菌15min備用。使用前，用過濾除菌方法加入 。 定性試驗采用沙氏培養(yǎng)液，除不加瓊脂外其他成分與制法同上。 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液成分：蛋白胨 氯化鈉 牛肉膏 蒸餾水 1000ml 制法：調(diào)節(jié)pH —，分裝， 115℃高壓滅菌20min備用。 澳甲酚紫葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基成分：蛋白胨 葡萄糖 蒸餾水 1000ml 制法：— ，加2％ , 115℃高壓滅菌20min備用。 革蘭氏染色液結(jié)晶紫染色液：結(jié)晶紫 95％乙醇 20ml 1％草酸銨水溶液 80ml 將結(jié)晶紫溶解于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。革蘭氏碘液碘 碘化鉀 蒸餾水 300ml 脫色劑 95 ％乙醇復(fù)染液： (1) 沙黃復(fù)染液：沙黃 95％乙醇 10ml 蒸餾水 90ml 將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。(2) 稀石炭酸復(fù)紅液： 稱取堿性復(fù)紅10g ，研細，加95％乙醇100ml ，放置過夜，濾紙過濾。取該液10ml,加5％石炭酸水溶液90ml混合，即為石炭酸復(fù)紅液。再取此液10ml ，加水90ml ，即為稀石炭酸復(fù)紅液。 / L 磷酸鹽緩沖液（PBS , )成分：磷酸氫二鈉 磷酸二氫鉀 蒸餾水 1000ml54 / 54