【正文】 證加試條前瓊脂表面完全干燥。 2．加樣：要確保加試條前已接種的瓊脂平板完全干燥。使用模板墊在平板下來準(zhǔn)確定位試條所在平板的位置。用鑷子（夾住試條的柄端即標(biāo)有E的區(qū)域）將試條放在已接種細菌的平板表面，記住試條記有MIC刻度面朝上，且濃度最大端要靠近平板邊緣，試條全長應(yīng)與瓊脂表面緊密接觸。必要時，可用鑷子輕壓試條以驅(qū)趕其下方的氣泡，并且總是從濃度最小端向上驅(qū)氣泡。試條下方的小氣泡往往不影響實驗結(jié)果。一旦放好，切勿再移動試條，因為抗生素在瞬間已擴散進入瓊脂。 3．孵育：放37℃溫箱培養(yǎng)過夜(不超過17h)。【結(jié)果】 達到要求的孵育時間且細菌的生長清晰可辨時(圖3—8)，即可在橢圓抑菌環(huán)與E試條的交界處讀取MIC值。當(dāng)細菌沿整個試條生長即無可見抑菌環(huán)時，MIC應(yīng)報告為大于讀數(shù)刻度的最高值。當(dāng)抑菌橢圓環(huán)伸至試條下方時，即環(huán)的邊緣與試條無交點時，MIC應(yīng)報告為小于讀數(shù)刻度的最低值。 （劉 兵）第四章 化膿性球菌的病原學(xué)檢測實驗1 化膿性球菌的病原生物學(xué)檢測程序 在臨床上，一般化膿性感染的診斷并不困難，有時為了確定病原菌種，選擇用藥，特別是疑似敗血癥患者須與其它發(fā)熱性疾病進行鑒別診斷時，方進行必要的微生物學(xué)檢查。本實驗通過膿汁病原菌檢查這一系統(tǒng)實驗過程，初步掌握化膿性球菌的檢查程序和鑒定方法。膿汁中病原球菌的檢查程序 膿 汁 ↓ 肉眼觀察 直接涂片 分離培養(yǎng)（血瓊脂平板） ↓ 革蘭氏染色 菌落觀察 革蘭氏染色 大小 溶血現(xiàn)象 +矛頭狀成對排列球形鏈狀排列球形葡萄狀排列 腎 不溶血草綠色溶血環(huán)透明溶血環(huán) 形 成 對 排 列菊糖發(fā)酵試驗?zāi)懼芫囼灨事洞及l(fā)酵試驗血漿凝固酶試驗 【材料】 ①膿汁(取自可疑化膿性球菌感染病人)或血液(取自可疑為敗血癥病人) ②血瓊脂平板 ③革蘭氏染色液 ④家兔血清 ⑤去氧膽酸鈉溶液(10％) ⑥生理鹽水 ⑦載物玻片，小試管等。 【方法】 1．標(biāo)本采集 ①一般用無菌棉棒(拭子)采取膿汁及病灶分泌物。 ②取材如遇深部膿腫時，用碘酒及酒精棉球消毒患部皮膚，然后再以無菌棉拭子采取潰瘍深處的分泌物。 ③采取膿腫處的膿汁，如懷疑有厭氧菌，最好用注射器抽取膿汁立即送檢。 ④標(biāo)本采取后應(yīng)及時檢查，如不能立即檢驗應(yīng)置冰箱中保存，以防雜菌污染。 ⑤對可疑為敗血癥的病人，按無菌操作采血5ml，立即注入葡萄糖肉湯培養(yǎng)基內(nèi)增菌，12～18h后再作分離培養(yǎng)。 2． 肉眼觀察 觀察膿汁性狀、色調(diào)、有無惡臭氣味等，如膿汁帶綠色時，可能有綠膿桿菌的感染，如有惡臭氣味可能有厭氧菌感染。 3．染色鏡檢 將膿汁直接涂片用革蘭氏染色觀察細菌形態(tài)、排列及染色性，在涂片上通?？梢姷礁锾m氏陽性暗紫色的球菌散在于薔薇色的白細胞之間或其中。 4．分離培養(yǎng) 將膿汁(或血液增菌材料)劃線接種于血瓊脂平板上，置37℃培養(yǎng)18—24h，觀察劃線上的菌落是一種或幾種，有無溶血環(huán)，從菌落中選最適于釣菌的代表菌落觀察，并用接種環(huán)取菌落的一部分作涂片，革蘭氏染色，鏡檢，觀察形態(tài)及染色性，結(jié)合菌落特點及涂片檢查，即可初步識別。將菌落的剩余部分移種于普通瓊脂(或血液瓊脂)斜面上，以便獲得大量純種細菌做進一步的檢查。 ①若菌落較大(2~3mm)，溶血、不透明、產(chǎn)生金黃色色素，涂片染色呈革蘭氏陽性，中等大小球菌，葡萄狀排列(或散在)則疑有葡萄球菌。然后再經(jīng)純種移植，做血漿凝固酶試驗和甘露醇發(fā)酵試驗，確定其致病力。 ②若菌落較小(1mm以下)，半透明，完全溶血，涂片染色革蘭氏陽性，散在或呈鏈狀排列的球菌，為溶血性鏈球菌。 若呈草綠色溶血時，為甲型溶血性鏈球菌，但應(yīng)做膽汁(膽鹽)溶解試驗和菊糖發(fā)酵試驗與肺炎球菌相鑒別。5．血漿凝固酶試驗 致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可凝固新鮮的人血漿或兔血漿。檢測此種酶的試驗，常用于鑒定葡萄球菌的致病力，以區(qū)別非致病性葡萄球菌。 ①玻片法 在載物片兩端各滴鹽水一滴，取葡萄球菌平板培養(yǎng)物放生理鹽水中混成均勻菌液，在其中一端的菌液中加兔血漿一滴搖勻，立即觀察結(jié)果，如血漿中有明顯小凝塊出現(xiàn)，而生理鹽水中無此現(xiàn)象者為陽性，若血漿中無凝塊時為陰性。此法較簡便，但不如試管法銳敏、準(zhǔn)確。 ②試管法 吸取1：4稀釋的兔血漿放于二支滅菌小試管中，每管0．5ml，用滅菌接種環(huán)沾取葡萄球菌培養(yǎng)物一滿環(huán)，在一小試管內(nèi)壁徐徐研磨使成均勻懸液。另一試管做為對照，將二試管放在37℃水浴箱中，每半小時觀察一次結(jié)果，觀察至4h。觀察時試管傾斜，凡血漿呈現(xiàn)膠胨樣凝集者即為陽性，仍呈液狀者為陰性。6．膽汁(膽鹽)溶解試驗 肺炎球菌能被膽汁或膽鹽溶解，甲型溶血性鏈球菌則不能，故可用做二者的鑒別。①取滅菌小試管二支，用滅菌接種環(huán)沾取試驗菌18—24h培養(yǎng)物分別在兩支小試管內(nèi)制成均勻的菌懸液。然后，其中一支加10％()。 ②搖勻，置37℃水浴箱，10～15min觀察結(jié)果，若加膽酸鹽(或加牛膽汁)管內(nèi)的菌懸液變成透明，對照管仍混濁者為陽性。肺炎球菌可被膽鹽溶解液體變?yōu)橥该?，而甲型溶血性鏈球菌不被溶解，液體仍呈混濁狀態(tài)．實驗2 細菌血漿凝固酶試驗 致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可凝固新鮮的人血漿或兔血漿。檢測此種酶的試驗，常用于鑒定葡萄球菌的致病力，以區(qū)別非致病性葡萄球菌。 (一)玻片法 在載物片兩端各滴鹽水一滴，取葡萄球菌平板培養(yǎng)物放生理鹽水中混成均勻菌液，在其中一端的菌液中加兔血漿一滴搖勻，立即觀察結(jié)果，如血漿中有明顯小凝塊出現(xiàn)，而生理鹽水中無此現(xiàn)象者為陽性，若血漿中無凝塊時為陰性。此法較簡便，但不如試管法銳敏、準(zhǔn)確。 （二）試管法 吸取1：4稀釋的兔血漿放于二支滅菌小試管中，用滅菌接種環(huán)沾取葡萄球菌培養(yǎng)物一滿環(huán)，在一小試管內(nèi)壁徐徐研磨使成均勻懸液。另一試管做為對照，將二試管放在37℃水浴箱中，每半小時觀察一次結(jié)果，觀察至4h，觀察時試管傾斜，凡血漿呈現(xiàn)膠胨樣凝集者即為陽性，仍呈液狀者為陰性。實驗3 細菌的觸酶試驗【材料】 3％過氧化氫水溶液(新鮮配制)，載玻片?！痉椒ā? 用接種環(huán)挑取固體培養(yǎng)基上的菌落，置于潔凈的試管內(nèi)或載玻片上過氧化氫溶液數(shù)滴，觀察結(jié)果?！窘Y(jié)果判定】 于半分鐘內(nèi)有大量氣泡產(chǎn)生者為陽性，不產(chǎn)生氣泡者為陰性。絕大多數(shù)細菌均產(chǎn)生過氧化氫酶，但鏈球菌屬的觸酶試驗為陰性，故常用此實驗來鑒別葡萄球菌和鏈球菌。此試驗不宜用血平板上的菌落，因紅細胞內(nèi)含有此酶，會出現(xiàn)假陽性。此外，陳舊培養(yǎng)物可丟失觸酶活性。實驗4 細菌耐熱核酸酶試驗 【原理】 金黃色葡葡萄球菌能產(chǎn)生一種耐熱核酸酶，它需Ca2+作為激活劑，對熱有顯著的抵抗力(100℃15分鐘)，而任何其它來源的DNA酶均不具有這種耐熱的性質(zhì)。此酶可使DNA長鏈水解成寡核苷酸，長鏈DNA可被酸沉淀，而水解后的寡糖核苷酸則可溶于酸。故于DNA瓊脂板上加入鹽酸，可在產(chǎn)生耐熱DNA酶的部位形成透明圈。因此，可將耐熱核酸酶作為檢測金黃色葡萄球菌的重要指標(biāo)之一。 【方法】 將被檢菌12—18h培養(yǎng)物置沸水中煮沸15min，冷卻后，吸取此培養(yǎng)物1~2滴，％DNA瓊脂平板表面，37℃孵育18~24h，然后用1MHC1傾注平板，觀察結(jié)果。 【結(jié)果判定】培養(yǎng)物部位有透明圈者為陽性，無透明圈者為陰性。此試驗可用于區(qū)分金黃色葡萄球菌和表皮及腐生葡萄球菌。實驗5 肺炎球菌對小白鼠的傳染試驗【目的】學(xué)習(xí)動物實驗感染的操作方法，了解肺炎球菌莢膜的致病作用。【材料】①小白鼠②感染肺炎球菌的小白鼠臟器研磨懸液③肺炎球菌血平板培養(yǎng)物制作的懸液④革蘭氏染色液⑤動物解剖用具(一套)，注射器、滅菌棉花紙包、碘酒棉球、酒精罐。 【方法】 (一)實驗動物的接種 1． 首先將兩種菌懸液做涂片，革蘭色染色和鏡檢，以便與后述死亡動物尸體的細菌學(xué)檢查結(jié)果對比。 2． 用消毒好的注射器，按無菌操作法抽取菌懸液后，再用無菌鑷子夾一滅菌棉花紙包，將針頭刺入棉花紙包內(nèi)，排出注射器內(nèi)的氣體，然后將注射器平置于試管架上。 3． 固定小白鼠(圖4—1)：用右手輕拖鼠尾，使其爬行于金屬網(wǎng)蓋上，再突然用左手拇食兩指抓緊小白鼠頸項部及兩耳，將鼠體搜入手掌中，再用左手無名指和手掌夾住小白鼠尾根，以無名指和小指夾住其左腿。 圖4—1小白鼠的抓取 圖4—2小白鼠的固定和腹腔內(nèi)注射 4． 以無菌鑷子取碘酒棉球，消毒小白鼠左下腹部，用鑷子取下注射器針頭上的棉花紙包，放入消毒罐中。左手傾斜，使小白鼠頭部向下，然后將注射器針頭自小白鼠左側(cè)腹股溝部刺入皮下，使針頭在皮下組織內(nèi)前進約l cm左右，再直立注射器，輕輕向F刺入腹腔內(nèi)(圖4—1)，注入菌液0．2ml后再將針頭拔出。 將小白鼠用染料涂抹做好標(biāo)記，放入動物罐中。 5． 在動物罐的標(biāo)簽上填寫動物的標(biāo)記、接種材料、途徑、接種量以及接種者的班級、學(xué)號、接種年、月、日等。逐日觀察，記錄觀察結(jié)果。 (二)動物解剖 如動物尚未死亡，應(yīng)先將其處死。解剖前一切解剖用具(如剪子、鑷子等)應(yīng)煮沸10分鐘消毒，并備一酒精瓶以便將解剖用具隨時沽取酒精，點燃消毒。將動物放3％來蘇水缸中浸泡5分鐘，取出后放解剖板上，使其腹部向上，四肢伸展，用大頭針或圖釘固定(圖4—2)。用碘酒棉球消毒胸腹部皮膚。用鑷子提起腹壁中央皮膚少許，用剪刀剪一小口，再把剪子插入小口內(nèi)剪開皮膚。如圖4—3所示，首先沿正中線由恥骨剪至下腭部，再向四肢剪開皮膚。小心剝離皮膚，觀察皮下組織的變化，有無血管擴張、出血、腹股溝和腋下淋巴結(jié)腫大或化膿等。圖4—3 小白鼠的固定菽皮映切開法 用鑷子把持劍突，由劍突下部開始用剪刀剪斷兩側(cè)肋骨與肋軟骨結(jié)合部位，向上翻轉(zhuǎn)揭開胸壁。觀察胸腔內(nèi)有無積液、肺和心臟的所見。無菌操作剪開心臟并用接種環(huán)沾取心血進行涂片，同時剪取肺組織塊進行涂片。剪開腹壁，打開腹腔。觀察腹腔有無積液，觀察腹部各臟器的狀態(tài)，特別是肝、脾的狀態(tài)，剪取臟器組織塊進行涂片。在進行上述涂片的同時,如必要也可取材接種到血平板上進行培養(yǎng).解剖完畢,將小白鼠尸體放于3%來蘇水缸中消毒,以待焚燒,將解剖板翻轉(zhuǎn)浸入來蘇水中消毒,器械用來蘇棉球擦凈后煮沸消毒。將上述涂片行革蘭氏染色,鏡檢,與接種的懸液涂片進行對比,并分析結(jié)果。 【附錄】 動物實驗法 動物實驗法是微生物學(xué)中常用的實驗操作技術(shù)之一，使用實驗動物可以進行病原體的分離、細菌毒力的測定、制備免疫血清和疫苗、以及進行各種皮膚試驗等。 1． 實驗動物的管理 ④實驗室常用的動物有家兔、豚鼠(荷蘭豬)、小白鼠、大白鼠、地鼠、綿羊、雞等，根據(jù)實驗的目的，選擇最適宜的動物。為使動物實驗準(zhǔn)確可靠，應(yīng)選用健康無病的動物，最好使用純種動物。購買的動物，一般至少要隔離觀察10天，證明無隱性傳染病方可使用。 ②實驗動物必須與正常動物分開飼養(yǎng)，動物室內(nèi)要經(jīng)常保持清潔和空氣暢通，并應(yīng)有防蚊、防蠅、防逃跑及保暖等設(shè)備。 ③實驗動物要精心飼養(yǎng)、喂以適當(dāng)?shù)娘暳?，并給以充足的飲水。 ④實驗動物要有詳細的記錄，包括性別、體重、體表特征(如毛色等)、接種材料、接種日期、接種途徑、劑量、次數(shù)以及接種后變化等。 ⑨實驗動物應(yīng)做好標(biāo)記，對較大動物如家兔、豚鼠等可用金屬號碼牌固定于耳朵上，對較小動物如大白鼠、小白鼠等可用復(fù)紅(紅色)和苦味酸(黃色)等染料涂于身體的不同部位，以資識別。盛裝動物的籠、罐上，也應(yīng)付以標(biāo)簽。 ⑥接種后的動物應(yīng)每天觀察l一2次，注意動物的精神狀態(tài)、活動能力，飲食和大小便情況、體溫、注射部位的反應(yīng)以及全身反應(yīng)，如不安、聳毛、震顫、弓背、麻痹及死亡等，并應(yīng)詳細記錄之。 ⑦感染動物死亡后，應(yīng)立即剖檢或暫放冰室內(nèi)保存。動物的排泄物及使用的籠罐等必須嚴(yán)格消毒，任何用過的動物，不宜再做其它試驗。 2．動物接種法． 接種時為了防止動物亂動應(yīng)以適當(dāng)方法固定，剪去或拔去接種部位的毛，進行皮膚消毒。接種用