體外受精與動(dòng)物克隆技術(shù)-資料下載頁(yè)
2025-01-21 14:22本頁(yè)面
【正文】 體處理 30分鐘，再用異硫氰酸鹽熒光素（ FITC）標(biāo)記的二抗處理，根據(jù)特異熒光判斷，有熒光者為雄胚，無(wú)熒光者為雌胚，將兩類胚胎移植后，判為雄胚者有 78％發(fā)育成雄鼠，判微雌胚者有 81％發(fā)育為雌鼠。 ? 此方法的主要優(yōu)點(diǎn)是不損害胚胎，亦具有適當(dāng)?shù)男詣e鑒定準(zhǔn)確率，但對(duì)熒光強(qiáng)度的估價(jià)則具有高度的主觀性。 ? 此外 ,胚胎質(zhì)量似乎也與熒光強(qiáng)度和類型有關(guān)，第二抗體有時(shí)發(fā)生非特異性結(jié)合，如與同卵周隙的細(xì)胞碎片結(jié)合等。 ? 囊胚形成抑制法 :利用 HY抗體對(duì)雄性桑椹胚向囊胚發(fā)育具有可逆性抑制的原理發(fā)展起的一種胚胎性別鑒定法。這種方法是一種簡(jiǎn)單而有效的胚胎性別鑒定方法。不足之處是容易將一部分發(fā)育遲緩的雄性胚胎誤判為雌性胚胎 ? 分子生物學(xué)方法 :指從胚胎取下少量細(xì)胞，將其 DNA與Y染色體特異標(biāo)記的 DNA序列（探針）雜交。在類似的研究中，用生物素標(biāo)記的 Y特異性探針進(jìn)行原位雜交，準(zhǔn)確率達(dá) 100％。 ? 此法的優(yōu)點(diǎn)是不用放射性標(biāo)記、設(shè)備簡(jiǎn)單、技術(shù)難度低，且可在 24小時(shí)之內(nèi)得到結(jié)果 . ? 缺點(diǎn)是可鑒定的胚胎較少。 ? 通過(guò)聚合酶連式反應(yīng)擴(kuò)增 Y染色體 DNA可大大增加靈敏度，改善準(zhǔn)確度。這種方法分析的靈敏度之高，甚至單個(gè)精子細(xì)胞的性別也可在 3小時(shí)之內(nèi)鑒定出來(lái)。當(dāng)前用 PCR進(jìn)行胚胎性別鑒定的最大問(wèn)題是污染，在采胚細(xì)胞時(shí)采到粘在胚胎上的精子、或切割刀粘上另一個(gè)胚胎的細(xì)胞、空氣中的污染、 PCR、試劑的污染以及培養(yǎng)液中的 BSA、 FCS都可能成為污染源、引致假陽(yáng)性結(jié)果。這就對(duì)操作過(guò)程提出了更嚴(yán)格的要求 7．胚胎移植 重組克隆胚胎移植的受體母畜要選擇皮毛顏色與供體品種不同、繁殖性能強(qiáng)、體格稍大的當(dāng)?shù)仄贩N，進(jìn)行同期發(fā)情處理，按常規(guī)方法移植代孕母畜（寄母）的子宮中，待其發(fā)育到產(chǎn)仔。 六、 核移植技術(shù)的應(yīng)用 1．制備轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物， 進(jìn)行生物藥物生產(chǎn)； 2．培育優(yōu)良畜種，擴(kuò)大良種種群 ； 3．開展異種動(dòng)物克隆，拯救瀕危動(dòng)物； 4．與干細(xì)胞技術(shù)結(jié)合，開展治療性克隆 5．利用核移植技術(shù)，研究生物學(xué)的基本問(wèn)題 。 七、克隆羊與體細(xì)胞核移植 , , microsatellite 第一步 取妊娠期的 6歲母綿羊（ Finn Dorset白品種母羊）的乳腺細(xì)胞作核供體細(xì)胞，用饑餓法使其進(jìn)入休眠狀態(tài)而使全部基因具有活性。 第二步 注射促性腺激素，促使母羊（ Sottish Blackface黑面母綿羊）排卵， 28~33小時(shí)取其未受精卵，快速去核，放入 10%FCS、 1%FCS和 %FCS連續(xù) 5天，使其進(jìn)入 G0期做受體細(xì)胞。 第三步 乳腺細(xì)胞與無(wú)核卵放入同一培養(yǎng)皿中，在微電流的作用下，將乳腺細(xì)胞融入卵中，形成一個(gè)含有新的遺傳物質(zhì)的卵細(xì)胞。 第四步 新的卵細(xì)胞植入羊的結(jié)扎的輸卵管內(nèi)， 6天后發(fā)育為桑椹胚或囊胚（ 8~16個(gè)細(xì)胞）。 第五步 將此早期胚胎移入假孕母羊子宮中，產(chǎn)下多利即為 6歲母羊的復(fù)制品，也為白色。 為何是突破性的工作： 第一，解決了使供體細(xì)胞與核受體細(xì)胞（去核卵細(xì)胞）同步的方法。 第二，解決了用體細(xì)胞做核供體與轉(zhuǎn)基因的問(wèn)題。 這一成果的重要生物學(xué)意義： 第一，它證明了一個(gè)已經(jīng)完全分化了的動(dòng)物體細(xì)胞仍然保持著當(dāng)初胚胎細(xì)胞的全部遺傳信息，并且經(jīng)此技術(shù)處理后，體細(xì)胞恢復(fù)了失去的全能性形成完整個(gè)體。 第二，多利是世界上首例利用成年哺乳動(dòng)物體細(xì)胞作為供體細(xì)胞繁殖的克隆羊，即成體母羊的復(fù)制品。它的成功提示我們可以進(jìn)一步做到，在培育體細(xì)胞成為核供體之前，利用 “ 基因靶 ” 技術(shù)精確地誘發(fā)核基因的遺傳改變或精確地植入目的基因，再用選擇技術(shù)準(zhǔn)確地挑選那些產(chǎn)生了令人滿意變化的細(xì)胞作為核供體，從而生產(chǎn)出基因克隆體。也就是說(shuō)，我們可以按照人的意志去改選、生產(chǎn)物種。 第三，在現(xiàn)代生物學(xué)領(lǐng)域中，沿有任何一項(xiàng)研究成果能夠比通過(guò)對(duì)基因進(jìn)行有規(guī)律地控制而解決更多的問(wèn)題的先例。多利羊的誕生及生長(zhǎng)表明，利用克隆技術(shù)復(fù)制哺乳類動(dòng)物的最后技術(shù)障礙已被突破，在理論上已成為可能。 八、克隆技術(shù)存在的問(wèn)題 理論問(wèn)題 ? 分化的體細(xì)胞克隆對(duì)遺傳物質(zhì)重編（細(xì)胞核內(nèi)所有或大部分基因關(guān)閉，細(xì)胞重新恢復(fù)全能性的過(guò)程）的機(jī)理還不清楚； ? 克隆動(dòng)物是否會(huì)記住供體細(xì)胞的年齡。 ? 克隆動(dòng)物的連續(xù)后代是否會(huì)累積突變基因。 ? 在克隆過(guò)程中胞質(zhì)線粒體所起的遺傳作用等問(wèn)題還沒(méi)有解決。 實(shí)踐問(wèn)題 ? 克隆動(dòng)物的成功率還很低 ? 生出的部分個(gè)體表現(xiàn)出生理或免疫缺限。 ? 即使是正常發(fā)育的“多莉”，也被發(fā)現(xiàn)有早衰跡象 ? 除了以上的理論和技術(shù)障礙外，克隆技術(shù)（尤其是在人胚胎方面的應(yīng)用）對(duì)倫理道德的沖擊和公眾對(duì)此的強(qiáng)烈反應(yīng)也限制了克隆技術(shù)的應(yīng)用。
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