限制性核酸內(nèi)切酶的命名-資料下載頁(yè)
2025-01-20 12:53本頁(yè)面
【正文】 切割速度大大加快 D. 識(shí)別序列與原來(lái)的完全不同 ? 3. 下面哪種不是產(chǎn)生星號(hào)活性的主要原因（） A. 甘油含量過(guò)高 B. 反應(yīng)體系中含有有機(jī)溶劑 C. 含有非 Mg2＋ 的二價(jià)陽(yáng)離子 D. 酶切反應(yīng)時(shí)酶濃度過(guò)低 其它 特異性的限制酶 ? Omega核酸酶（ ISceI） 由釀酒酵母線粒體 rRNA基因中的內(nèi)含子編碼，用于 rRNA的剪切 5’TAGGGATAA↓CAGGGTAAT3’ ↑TATT 其它 特異性的限制酶 ? IPpoI： 來(lái)自于多頭絨胞菌 Physarum polycephalum 基因內(nèi)含子 5’ CTCTCTTAA↓GGTAGC 3’ ↑AATT DNA的片段化 ? 定義：無(wú)論是生物材料制備的天然 DNA，還是化學(xué)合成的 DNA，往往需要用限制性核酸內(nèi)切酶進(jìn)行切割，使其可用于連接重組的 DNA片段，即DNA分子的片段化 ? 切割方法： ? 單酶切 ? 雙酶切 ? 部分酶切 單酶切 ? 用一種限制性核酸內(nèi)切酶切割 DNA樣品 ? 完全酶切后產(chǎn)生的片段由 DNA的形狀和酶切位點(diǎn)數(shù)決定 。 ? 如：線性 DNA分子，酶切后的片段＝ N＋ 1 ? 環(huán)狀分子，酶切后的片段＝ N 雙酶切 ? 用兩種不同的酶切割同一種 DNA分子 ? 1）需兩種酶切同一分子，酶對(duì)鹽濃度相同，可同時(shí)反應(yīng)。 ? 2）兩種酶切同一分子，酶對(duì)鹽濃度要求差別大，低高鹽，不可 同時(shí)反應(yīng)。 ? a) 低鹽組先切，加熱滅活后，補(bǔ)加鹽濃度再切。 ? b) 沉淀后重新加入另一種鹽濃度緩沖液 ? c）兩種酶不能同時(shí)反應(yīng)，有先有后。 部分酶切 ? 用限制性內(nèi)切酶對(duì) DNA分子上的全部識(shí)別序列進(jìn)行不完全的切割 ? 導(dǎo)致不完全切割的 原因 ： ? 底物 DNA的純度、識(shí)別序列的甲基化、酶的用量不足、反應(yīng)緩沖液或溫度不適以及酶切時(shí)間不足等 用 途 ? 確定 DNA分子的限制性圖譜 限制酶作圖 (Restriction Mapping)基本原理 1Kb Eco RI 待檢的 DNA Bam HI 15Kb 6Kb 5Kb 10Kb 9Kb E B B H H E H H H H E+B E B 6Kb E H 4Kb E B 5Kb B H Eco RI Bam HI Eco RI+ Bam HI 結(jié)論 1 B E B B 結(jié)論 2 B E B B 如何確定哪種結(jié)論正確？ 答：部分限制性酶切 Bam HI 酶切位點(diǎn)的確定 line DNA W=N+1 ccc DNA W=N 問(wèn)題 ? DNA的 BamH I限制性片段的限制性圖譜，分別用 EcoR I、 Hpa II、 EcoR I+Hpa II消化這一片段的三個(gè)樣品，然后通過(guò)凝膠電泳分離 DNA片段，溴乙錠染色后觀察 DNA帶型（見(jiàn)圖）。請(qǐng)根據(jù)這些結(jié)果繪制一個(gè)限制性圖譜，要標(biāo)明 EcoR I和 Hpa II識(shí)別位點(diǎn)間的相對(duì)位置，以及它們之間的距離（ kb） DNA連接酶 ? 特性： ? DNA連接酶廣泛存在于各種生物體內(nèi)，其催化的基本反應(yīng)是： 將 DNA雙鏈上的相鄰堿基的 5’PO4和 3’OH共價(jià)結(jié)合形成 3’5’磷酸二酯鍵 DNA連接酶 DNA連接酶不能夠連接兩條單鏈 DNA分子或環(huán)化單鏈 DNA。實(shí)際上， DNA連接酶是封閉雙螺旋DNA骨架上的切口（ nick） ? 分類： ? DNA連接酶 ? T4DNA連接酶 ? Tsc DNA連接酶 ? 區(qū)別 ： ? 催化反應(yīng)中能量來(lái)源不同 ? 連接能力不同 ? 分子量大小 ? 連接反應(yīng)是一個(gè)吸能的反應(yīng)， 及其它細(xì)菌以 NAD為能源，動(dòng)物及噬菌體以 ATP為能源 ? 基因工程中常用的 DNA連接酶是 T4噬菌體DNA連接酶 ? 連接酶的最佳反應(yīng)溫度是 37℃ ，但在這個(gè)溫度下，粘性末端之間的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的，因此連接反應(yīng)的溫度一般在 4~15℃ ， Tsc DNA連接酶在 90 ℃ 以上高溫仍保持活性。
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