金牌原創(chuàng)]第七章層析分離技術(shù)-資料下載頁
2025-01-18 20:05本頁面
【正文】 不清。 ? （六）層析柱底部棉花的用量不宜過多，松緊要適宜，否則將影響流速。 實驗十一 離子交換色譜分離混合氨基酸 一、實驗準備 ? （一）實驗原理及目的 ? 原理 本實驗采用磺酸型陽離子交換樹脂分離酸性氨基酸天冬氨酸（ Asp， pI=，分子量為 ）和堿性氨基酸賴氨酸（ Lys， pI=，分子量為 ）的混合液。在 pH=，因為 pH值低于 Lys的 pI值， Lys可解離成陽離子結(jié)合在樹脂上； Asp可解離成陰離子，不被樹脂吸附而流出層析柱。在 pH=12條件下，因 pH值高于 Lys的 pI值， Lys可解離成陰離子從樹脂上被交換下來。這樣，通過改變洗脫液的 pH值可使它們被分別洗脫而達到分離的目的。 ? 目的 (1)、了解離子交換樹脂分離氨基酸基本原理 (2)、掌握陽離子交換樹脂處理技 ? （二）試劑及器具 材料 磺酸型陽離子交換樹脂（ 732型） 試劑 樹脂處理液： 2mol/LNaOH、 2mol/L HCL、 1mol/L HCL、1mol/L NaOH、 （ pH=）、（ pH=12）、天冬氨酸、賴氨酸、茚三酮、無水乙醇。 器具 離子交換色譜柱、量筒、吸管、收集器、試管、恒流泵。 二、實驗過程 樹脂處理、轉(zhuǎn)型 裝柱 平衡 上樣 洗脫 收集 測定 三、注意事項 ? （一）為使分離色帶整齊，裝柱時層析柱一定要無裂縫和氣泡。 ? （二）分離洗脫過程中，要連續(xù)不斷加入洗脫液，并保持一定高度的液面，在整個操作中絕不能使樹脂表面的液體流干。 ? （三）一直保持流速 10滴 /min～ 12滴 / min，并注意勿使樹脂表面干燥。 實驗十二 凝膠柱層析分離蛋白質(zhì) 一、實驗準備 ? （一）實驗原理及目的 ? 原理： ? 凝膠層析（ gel chromatography）是利用某些凝膠對于不同組分因分子大小不同而阻滯作用不同的差異而進行分離的技術(shù)。當溶液在層析柱內(nèi)流過時，各種物質(zhì)分子在柱內(nèi)同時進行向下的移動和不定向的分子擴散運動。大分子物質(zhì)由于分子直徑大，難于進入凝膠顆粒的微孔，只能在凝膠顆粒的間隙中隨流動相快速向下移動；而小分子物質(zhì)能夠擴散進入凝膠顆粒的微孔中，因此在流動過程中不斷地進出于膠粒的微孔，這樣就使小分子物質(zhì)向下移動的速度落后于大分子物質(zhì)，從而使溶液中的各組分按分子量從大到小的順序先后流出層析柱，達到分離純化的目的。 ? 本實驗主要學習葡聚糖凝膠柱層析分離（凝膠過濾）的基本操作技術(shù)環(huán)節(jié)，如柱層析填充介質(zhì)（凝膠）的溶脹、裝柱、平衡、洗脫等。 ? 目的： （ 1）熟悉凝膠層析分離的基本原理； （ 2）掌握凝膠柱層析填充物的裝柱、平衡、加樣、洗脫等基本操作技術(shù) ? （二）試劑及器具 材料 Sephadex G50（或 G75）、藍色葡聚糖 202牛血清蛋白 試劑 磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、 。 緩沖液的配制方法：先稱取一定量的磷酸氫二鈉和磷酸二氫鉀，用去離 子水分別溶解、配制成 3L濃度為 ，然后將這兩種溶液邊按一定比例混合，邊用酸度計檢測，調(diào)配成 酸鹽緩沖液 器具 酸度計、層析柱（ 30cm）、鐵架臺、試管（多個）紫外分光光度計或紫外檢測儀、電爐、容量瓶（ 1L）、燒杯、三角瓶、滴管、移液管、電子天平、玻棒、塑料壺（ 3~5L）。 二、實驗過程 凝膠溶脹 裝柱 平衡 加樣 洗脫 繪制曲線 三、注意事項 ? （一）層析柱大小可根據(jù)實際需要選擇，一般來說，細長的柱分離效果較好。若樣品量多，最好選用內(nèi)徑較粗的柱，但此時分離效果稍差。柱管內(nèi)徑太小時，會發(fā)生管壁效應(yīng)，即柱管中心部分的組分移動慢，而管壁周圍的移動快。柱越長，分離效果越好，但柱過長，實驗時間長，樣品稀釋度大，分離效果反而不好。 ? （二）裝好的層析柱凝膠要均勻，不能有斷層或紋路或氣泡，將柱管對著光照方向觀察，若層析柱床不均勻，必須重新裝柱。 ? （三）各接頭不能漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損，否則造成漏氣、漏液。操作過程中，層析柱內(nèi)液面不斷下降，則表示整個系統(tǒng)有漏氣之處，應(yīng)仔細檢查并加以糾正。 ? （四）始終保持柱內(nèi)液面高于凝膠表面，否則水分揮發(fā)，凝膠變干。也要防止液體流干，使凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內(nèi)的流動，導致分離效果變差，不得不重新裝柱。 ? （五）洗脫用的液體應(yīng)與凝膠溶脹所用液體相同，否則，由于更換溶劑引起凝膠容積變化，從而影響分離效果。
教學課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1