生物化學(xué)和分子生物學(xué)(1)-資料下載頁(yè)
2025-01-18 02:14本頁(yè)面
【正文】 體 DNA是裸露的環(huán)形 DNA，其轉(zhuǎn)錄和翻譯是偶聯(lián)的連續(xù)進(jìn)行。 2. 原核生物形成多順反子 mRNA： mRNA在合成過程中和多個(gè)核糖體結(jié)合，翻譯形成多條肽鏈。 一般不含內(nèi)含子（ intron），沒有轉(zhuǎn)錄及翻譯后加工系統(tǒng) 。 原核生物中功能相關(guān)的基因串聯(lián)在一起 ， 形成操縱子 。 操縱子 是一組功能上相關(guān) ， 受同一調(diào)控區(qū)控制的基因組成的一個(gè)遺傳單位 。 啟動(dòng)子 (promoter, P)是指能被 RNA聚合酶識(shí)別、結(jié)合并啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄的一段 DNA序列。 ? 一般長(zhǎng) 4060bp，富含 AT堿基對(duì) ? 具有保守序列： 10區(qū)（ pribnow box）： TATAAT 35區(qū)： 終止子（ terminator， T） :位于基因 3’端 ,給予 RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的 DNA序列 原核生物中參與轉(zhuǎn)錄的基因結(jié)構(gòu)： 翻譯起始密碼子 AUG 或 GUG SD順序 （ shinedalgarno） ： ? AUG上游 311 bp ? 長(zhǎng)約 39bp ? mRNA與 16s核糖體亞基間的識(shí)別與結(jié)合序列 與翻譯有關(guān)的原核細(xì)胞結(jié)構(gòu)： —— 核糖體結(jié)合位點(diǎn) 人類對(duì)大腸桿菌經(jīng)過長(zhǎng)期的研究，對(duì)其特性和遺傳背景了解得最清楚，大腸桿菌培養(yǎng)操作簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)繁殖快、價(jià)格低廉，人們用大腸桿菌用外源基因的表達(dá)工具已有幾十年的經(jīng)驗(yàn)積累，大腸桿菌表達(dá)外源基因產(chǎn)物的水平遠(yuǎn)高于其它基因表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)的目的蛋白量甚至能超過細(xì)菌總蛋白量的 80%。因此大腸桿菌是目前應(yīng)用最廣泛的蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)。 設(shè)計(jì)外源基因在大腸桿菌表達(dá)就需要外源基因在大腸桿菌中表達(dá)所需要的元件， 包括轉(zhuǎn)錄起始必需的啟動(dòng)子 、 翻譯起始所必需的核糖體識(shí)別序列 等 ；外源基因表達(dá)的產(chǎn)物可能會(huì)對(duì)大腸桿菌有毒害作用，會(huì)影響細(xì)菌的生存繁殖，所以大多數(shù)表達(dá)載體都帶有 誘導(dǎo)性表達(dá)所需要的元件 ，即有 操縱子序列以及與之配套的調(diào)控基因 等；外源基因還應(yīng)當(dāng)插入到適合于表達(dá)的位置，所以表達(dá)載體中要設(shè)有適合的 多克隆位點(diǎn) ；此外還應(yīng) 具備基因克隆篩選的條件 ，包括在細(xì)胞中復(fù)制必需的 復(fù)制起始序列 、 篩選標(biāo)志 如抗藥性基因等。 原核表達(dá)載體 (expressing vector) ? 特點(diǎn)：帶表達(dá)構(gòu)件 — 轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的 DNA序列 ? 大腸桿菌表達(dá)載體：含啟動(dòng)子 — 核糖體結(jié)合位點(diǎn) — 克隆位點(diǎn) — 轉(zhuǎn)錄終止信號(hào) – 啟動(dòng)子： trplac(tac)啟動(dòng)子、 λ噬菌體 PL啟動(dòng)子、 T7噬菌體啟動(dòng)子 – 核糖體結(jié)合位點(diǎn) (ribosomebinding site,RBS)：起始密碼子 (ATG)和 SD序列 – 轉(zhuǎn)錄終止序列 影響外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)效率的因素： 啟動(dòng)子 終止子 SD mRNA 多肽鏈 原核表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn) ①?zèng)]有真核轉(zhuǎn)錄后加工的功能，不能進(jìn)行 mRNA的剪接，所以只能表達(dá) cDNA而不能表達(dá)真核的基因組基因； ②沒有真核翻譯后加工的功能，表達(dá)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，不能進(jìn)行糖基化、磷酸化等修飾，難以形成正確的二硫鍵配對(duì)和空間構(gòu)像折疊，因而產(chǎn)生的蛋白質(zhì)常沒有足夠的生物學(xué)活性； ③表達(dá)的蛋白質(zhì)經(jīng)常是不溶的，會(huì)在細(xì)菌內(nèi)聚集成包涵體（inclusion body），尤其當(dāng)表達(dá)目的蛋白量超過細(xì)菌體總蛋白量 10%時(shí)，就很容易形成包涵體。生成包涵體的原因可能有是蛋白質(zhì)合成速度太快，多肽鏈相互纏繞，缺乏使多肽鏈正確折疊的因素，導(dǎo)致疏水基因外露等。細(xì)菌裂解后，包涵體的離心后的沉淀中，雖然有利于目的蛋白的初步純化，但無生物活性的不溶性蛋白，要經(jīng)過復(fù)性（renaturation），使其重新散開、重新折疊成具有天然蛋白構(gòu)象和良好生物活性的蛋白質(zhì)，常常是一件很困難的事情。也可以設(shè)計(jì)載體使大腸桿菌分泌表達(dá)出可溶性目的蛋白，但表達(dá)量往往不高。 真核表達(dá)系統(tǒng)的必要性及優(yōu)勢(shì) 1. 具轉(zhuǎn)錄后加工系統(tǒng) 2. 具翻譯后修飾系統(tǒng) 3. 可實(shí)現(xiàn)真正的分泌表達(dá) 4. 基因治療 基因載體 目的基因 質(zhì)粒 噬菌體 病毒 PCR cDNA 化學(xué)合成 基因組文庫(kù) 限制性內(nèi)切酶 有切口的載體 有切口的目的基因 DNA連接酶 重組體 轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)染 體外包裝 帶重組體的宿主細(xì)胞 表型篩選 電泳法 核酸雜交 免疫學(xué)方法 目的基因的表達(dá) 基因工程用于生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物 ? 治療糖尿病的 胰島素 ，是一種 51 個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì) ? 1982 年美國(guó) EliLilly 公司推出基因工程制造的人胰島素，商品名為 (Humulin)。 ? 干擾素 用于治療肝炎等病毒感染性疾病，有良好療效。 ? 1 升發(fā)酵液中所得的干擾素相當(dāng)于過去從 1000 升人血中所得。生產(chǎn)成本也大為降低。 ? 目前用基因工程生產(chǎn)的蛋白質(zhì)藥物已達(dá)數(shù)十種，許多以前本不可能大量生產(chǎn)的 生長(zhǎng)因子 ， 凝血因子 等蛋白質(zhì)藥物，現(xiàn)在用基因工程辦法便可能大量生產(chǎn)。
環(huán)評(píng)公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1