外源基因的表達ppt課件-資料下載頁
2025-01-17 17:10本頁面
【正文】 中的 拷貝數(shù)較低，但能穩(wěn)定 存在于宿主細胞中，甚至在沒有抗生素選擇壓力下也不易造成質(zhì)粒的丟失。 ② 啟動子 芽孢桿菌含多種 轉(zhuǎn)錄起始識別因子 （ σ）。 芽孢桿菌啟動子的表達具有明顯的 時序性 ，它與菌體的生長周期和生理代謝活動密切相關(guān)。 ③ 表達載體 自主復(fù)制質(zhì)粒： 是一類 穿梭質(zhì)粒 ，能在 大腸桿菌 中復(fù)制，同時含有能在芽孢桿菌中復(fù)制的起始序列，因而也能在 芽孢桿菌 中進行自主復(fù)制。 整合質(zhì)粒： 在大腸桿菌質(zhì)?；A(chǔ)上構(gòu)建而成，不含在芽孢桿菌進行復(fù)制的起始序列，因而不能在芽孢桿菌中自主復(fù)制，但它能 插入到宿主染色體 并將外源基因和標記基因整合到染色體上，隨細胞染色體復(fù)制而復(fù)制，該方式表達外源基因解決了芽孢桿菌中質(zhì)粒不能穩(wěn)定遺傳的問題。 噬菌體： 以芽孢桿菌溫和型噬菌體構(gòu)建的表達載體能將外源基因 定位整合到染色體 上，并且在合適條件下（溫度）誘導(dǎo)外源基因表達。 宿主菌 常用的宿主菌 枯草芽孢桿菌 短小芽孢桿菌 地衣芽孢桿菌 外源基因在芽孢桿菌中的分泌表達 芽孢桿菌的細胞膜不同與大腸桿菌，通常只有一層細胞膜 ，當(dāng)分泌型蛋白質(zhì)跨膜后就進入到培養(yǎng)基中，因此，外源蛋白的表達量可以達到很高的水平，其表達量可達 30g/L。 在芽孢桿菌中高效表達外源基因的策略 提高表達質(zhì)粒在細胞中的穩(wěn)定性 滅活芽孢桿菌胞外蛋白酶 三、鏈霉菌表達系統(tǒng) 鏈霉菌 —— 是一種 革蘭氏陽性細菌 ，廣泛分布于土壤中，能夠產(chǎn)生多種生理活性物質(zhì)。 ?鏈霉菌作為外源基因表達的受體細胞所具有的特點： ?為非致病性細菌，不產(chǎn)生內(nèi)毒素； ?可進行外源蛋白的分泌表達； ?可進行高密度培養(yǎng)，具有豐富的次級代謝途徑和初、次級代謝調(diào)控體系，表達外源蛋白的時間較長； ?鏈霉菌在傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中應(yīng)用歷史悠久，有良好的工業(yè)化基礎(chǔ)。 鏈霉菌基因表達載體 ?啟動子 結(jié)構(gòu)多樣，至少存在三類鏈霉菌基因的啟動子： ?與大腸桿菌基因 10區(qū)和 35區(qū)類似的啟動子 ?僅與大腸桿菌基因 10區(qū)類似的啟動子 ?與大腸桿菌基因 10區(qū)和 35區(qū)序列均不相同的啟動子 ?核糖體結(jié)合位點 類似于其它原核生物的 SD序列： 5′(A/G)GGAGG3′。 ?終止子 具有較長的不完全互補反向重復(fù)序列，可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。 ?密碼子 ?鏈霉菌對編碼蛋白質(zhì)的 密碼子 具有明顯的 偏愛性 。 ?編碼蛋白質(zhì)的堿基序列中 GC的平均含量高達 73％，密碼子的第一、第二和第三位堿基的 GC含量分別達 66％、 53％和 93％，而該現(xiàn)象不存在于非編碼區(qū)。 ?在所有氨基酸的簡并密碼子中某些密碼子使用頻率低于 2％。 ?密碼子的 第三位堿基 具有明顯的選擇性，一般 C的頻率明顯高于 G的頻率 。 宿主菌 變鉛青鏈霉菌 天藍色鏈霉菌 —— 是整個鏈霉菌屬中分子遺傳學(xué)研究最清楚的菌體，但它具有較強的修飾系統(tǒng)。 主要有 ?變鉛青鏈霉菌作為外源基因表達的受體細胞所具有的優(yōu)點： ?遺傳背景清楚，不含內(nèi)源性質(zhì)粒； ?對外源 DNA無明顯的修飾作用； ?能高效表達鏈霉菌基因以外的其它基因； ?具有高效的異源蛋白分泌系統(tǒng)，并且其內(nèi)源蛋白酶和外源蛋白酶合成量低。 四、藍藻表達系統(tǒng) 藍藻 —— 又稱 藍綠藻 或 藍細菌 ，它含有葉綠素 a(缺乏葉綠素 b)和藻膽素，具有光合系統(tǒng) Ⅰ (PS Ⅰ ) 和光合系統(tǒng) Ⅱ (PS Ⅱ )、能進行光合作用，但它又 具有細菌的特征，無細胞核及雙層膜結(jié)構(gòu)的細胞器，染色體裸露，是一種典型的原核生物。 藍藻與真核生物藻類最大的區(qū)別是： 它無葉綠體，無真核，有 70S核糖體，細胞壁中含有肽聚糖，因而對青霉素和溶菌酶十分敏感等。 藍藻外源基因表達載體 穿梭質(zhì)粒表達載體 基因整合平臺系統(tǒng)供體質(zhì)粒表達載體 為使外源目的基因在藍藻細胞內(nèi)能高效表達，表達載體上組裝了 含有不同啟動子的基因表達盒 用作外源基因表達的宿主藍藻 藍藻作為表達外源基因的受體菌兼具 微生物和植物的優(yōu)點： ?基因組為原核型，除了裸露的染色體 DNA外，不含葉綠體 DNA和線粒體 DNA，遺傳背景簡單，便于基因操作和外源 DNA的檢測。 ?細胞壁屬 G－ ，主要由肽聚糖組成，便于外源DNA的轉(zhuǎn)化。 ?營光合自養(yǎng)生長，培養(yǎng)條件簡單，只需光、 CO無機鹽、水和適宜的溫度就能滿足生長需要。 ?多種藍藻含內(nèi)源質(zhì)粒，為構(gòu)建藍藻質(zhì)粒載體提供了極好的條件。 ?藍藻富含蛋白質(zhì)，并且多數(shù)藍藻無毒，早已用作食物或保健品，在此基礎(chǔ)上采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，把一些重要藥物的基因轉(zhuǎn)入無毒藍藻，就可達到錦上添花的效果。 藍藻在各生長時期均處于感受狀態(tài) ，均可用于轉(zhuǎn)化，但通常采用對數(shù)生長中期到后期的細胞進行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化過程中遮光或添加光合作用抑制劑可提高轉(zhuǎn)化效率。 外源目的基因在藍藻細胞中的表達 在藍藻細胞中高效表達外源目的基因的策略 ?構(gòu)建在藍藻細胞中穩(wěn)定性好的表達載體系統(tǒng)。 ?組裝含強啟動子的外源基因表達盒。 ?外源基因融合表達。
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