【正文】 汽滅菌鍋 LDZX50KB 上海申安醫(yī)療器械廠 生物顯微鏡 BK5000 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司 臺(tái)式離心機(jī) TGL16C 上海菲恰爾分析儀器有限公司 無菌操作臺(tái) SWCJ2F 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司 移液槍 KHB 上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司 超純水系統(tǒng) 618141 德國 SG 公司 電泳槽 DYCP31 北京六一儀器廠 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 DYY5 北京六一儀器廠 PCR 儀 MG48+ 杭州郎基科學(xué)儀器有限公司 紫外凝膠成像儀 WFH101B 美國 BioRad 公司 電子天 BS 124S 北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司 冰箱 BCD155TDGA 青島海爾股份有限公司 培養(yǎng)基 NA 培養(yǎng)基 (NA)：牛肉膏 3g、蛋白胨 10g、 NaCl 5g、瓊脂 20g、蒸餾水 1000 mL、 pH ，用于細(xì)菌的分離、培養(yǎng)及保存。 PDA 培養(yǎng)基 (PDA)：馬鈴薯 200g、葡萄糖 20 g、瓊脂 20 g、蒸餾水 1000 mL、pH 自然，用于病原真菌的培養(yǎng)、保存。 LB 培養(yǎng)基 (LB)：蛋白胨 10g、酵母膏 5g、氯化鈉 10g、蒸餾水 1000 mL、pH ，用于細(xì)菌的液體培養(yǎng)。 廣譜高效微生物防腐劑產(chǎn)生菌的篩選及應(yīng)用 11 供試有害微生物 表 24 供試有害微生物 有害微生物 來源 大腸桿菌 (Escherichia coli) 實(shí)驗(yàn)室保存 金黃色葡萄球菌 (Staphyloccocus aureus) 實(shí)驗(yàn)室保存 黃曲霉 (Aspergillus flavus) 實(shí)驗(yàn)室保存 黑曲霉 (Aspergillus niger) 實(shí)驗(yàn)室保存 擴(kuò)展青霉 (Penicillium expansum) 實(shí)驗(yàn)室保存 禾谷鐮刀菌 (Fusarium graminearum) 實(shí)驗(yàn)室保存 細(xì)極鏈格孢 (Alternaria tenuissima) 實(shí)驗(yàn)室保存 方法 微生物培養(yǎng) 將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌劃線接種于 NA 斜面上， 37℃ 恒溫培養(yǎng) 24h。 分別將黃曲霉、黑曲霉、擴(kuò)展青霉、禾谷鐮刀菌、細(xì)極鏈格孢接種于 PDA平板上， 28℃ 恒溫培養(yǎng) 5d 后，用無菌打孔器在培養(yǎng)好的各真菌平板上打孔，得到直徑 6mm 的病原真菌菌餅。 細(xì)菌菌株分離純化 準(zhǔn)確稱取 25g 土壤樣品，放入裝有玻璃珠和 225mL 無菌水的三角瓶中，振蕩 30min，得到樣品懸液。在無菌條件下，用無菌水對(duì)樣品懸液進(jìn)行梯度稀釋，得到 101~108 濃度的稀釋液。分別吸取各稀釋度的樣品懸液 均勻涂布于NA 平板上， 30℃ 恒溫培養(yǎng) 24h~36h 后，觀察長出菌落的形態(tài)、顏色、透明度等特征，挑取形態(tài)差異明顯的菌落進(jìn)行劃線純化、編號(hào)、保存?zhèn)溆谩? 菌懸液制備 取活化好的待測(cè)細(xì)菌菌株、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌斜面，分別用 10mL無菌生理鹽水沖洗各菌株斜面，渦旋振蕩混勻后，平板菌落計(jì)數(shù)，然后用無菌生理鹽水將各菌體濃度均調(diào)整為 106CFU/mL，即得到待測(cè)細(xì)菌及指示菌菌懸液。 河南工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 12 拮抗菌株初篩 采用濾紙片法 (He, 2022)考察待測(cè)細(xì)菌菌株對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制能力。分別取 20mL 大腸桿菌和金黃色葡 萄球菌菌懸液，同 200mL 冷卻至55℃ 左右的 NA 培養(yǎng)基充分混勻后倒平板，待其凝固后，分別于距離平板中央 處的四個(gè)點(diǎn)上放置四個(gè)已滅菌的直徑 8mm 的濾紙片，然后緩慢向?yàn)V紙片滴加 15μL待測(cè)細(xì)菌菌懸液，以 15μL無菌水作為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù) 3 次， 37℃恒溫培養(yǎng) 24h 后，觀察是否有抑菌圈出現(xiàn)，測(cè)量并記錄抑菌帶寬。 采用平板對(duì)峙培養(yǎng)法 (Sanket, 2022)考察待測(cè)細(xì)菌菌株對(duì)病原真菌的抑制能力。在 PDA 平板中央接入直徑 6mm 的病原真菌菌餅，分別于距離平板中央 處的四個(gè)點(diǎn)接種待測(cè)細(xì)菌，以未接種待測(cè)細(xì)菌的平板作為對(duì)照。每個(gè)處理重復(fù) 3次， 28℃ 恒溫培養(yǎng) 5d，定期查看病原真菌的生長情況，測(cè)量并記錄抑菌帶寬。 拮抗菌株無細(xì)胞培養(yǎng)濾液制備 將初篩得到的拮抗菌株在 NA 培養(yǎng)基上活化后，接入裝有 50mL LB 培養(yǎng)液的250mL 三角瓶中， 30℃ 、 175rpm 振蕩培養(yǎng) 12h 后，以 5%(v/v)的接種量接入裝有200mL LB 培養(yǎng)液的 500mL 三角瓶中， 30℃ 、 175rpm 振蕩培養(yǎng) 48h，得到拮抗菌株發(fā)酵液。將發(fā)酵液在 4℃ 條件下， 12022rpm 離心 15min，收集上清液。 上清液經(jīng) ， 4℃ 保存、備用。 拮抗菌株的復(fù)篩 采用牛津杯法 (foldes, 2022)對(duì)初篩得到的抑菌效果較好的拮抗菌株進(jìn)行復(fù)篩。按照 中的方法制備含有大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的 NA 平板，分別于距離平板中央 處的四個(gè)點(diǎn)放置 4 個(gè)已滅菌的牛津杯，取 150μL 拮抗菌株無細(xì)胞培養(yǎng)濾液于牛津杯中，以向牛津杯中加入 150μL 無菌水為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù) 3 次， 37℃ 恒溫培養(yǎng) 24h 后，觀察實(shí)驗(yàn)組平板是否有抑菌圈出現(xiàn)，測(cè)量并記錄抑菌圈直徑。 在 PDA 平板 中央接入直徑為 6mm 的病原真菌菌餅，分別于距離病原真菌菌餅中央 處的四個(gè)點(diǎn)放置 4 個(gè)已滅菌的牛津杯，取 150μL 拮抗菌株無細(xì)胞培養(yǎng)濾液于牛津杯中，以向牛津杯中加入 150μL 無菌水為空白對(duì)照，每個(gè)處理重復(fù) 3 次， 28℃ 恒溫培養(yǎng) 5d，定期查看病原真菌的生長情況，測(cè)量并記錄抑菌帶寬度。 廣譜高效微生物防腐劑產(chǎn)生菌的篩選及應(yīng)用 13 拮抗菌株形態(tài)特征觀察 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》 (東秀珠和蔡妙英， 2022)對(duì)拮抗菌株進(jìn)行傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定，包括菌株個(gè)體形態(tài)、大小及排列情況，革蘭氏染色，有無運(yùn)動(dòng)性，鞭毛的著生位置和數(shù)目，有無芽孢及芽孢的著生部位和 形狀，細(xì)胞個(gè)體發(fā)育過程中形態(tài)變化的規(guī)律性，是否有莢膜，菌落形態(tài)、大小、顏色、黏稠度、透明度、表面性質(zhì)、邊緣及隆起情況等。 拮抗菌株生理生化特性分析 參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》 (東秀珠和蔡妙英， 2022)進(jìn)行拮抗菌株的生理生化試驗(yàn)，包括需氧性、運(yùn)動(dòng)性、生長溫度、葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、 VP 試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、酪蛋白水解試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、耐鹽性試驗(yàn)、纖維素降解試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、尿素利用試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、 營養(yǎng)肉湯生長試驗(yàn)等。 拮抗菌株 16S rDNA 序列分析 細(xì)菌基因組 DNA 提取 將篩選得到的拮抗菌株在 NA 培養(yǎng)基上活化后，接入裝有 10mL LB 培養(yǎng)液的50 mL 三角瓶中， 30℃ 、 175 rpm 振蕩培養(yǎng) 12h。取拮抗菌株培養(yǎng)液 1mL， 12022rpm離心 2min，收集菌體。按照細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒（北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司）操作說明書提取拮抗菌株的基因組 DNA。 16S rDNA 序列擴(kuò)增 以 16S rDNA 通用引物 27F 和 1492R 為引物，以提取得到的拮抗菌株基因組DNA 為模板對(duì)拮抗菌株的 16S rDNA 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。依照表 25，冰浴配制 30μL PCR 反應(yīng)體系。 PCR 反應(yīng)條件為， 95℃ 預(yù)變性 3min； 95℃ 變性 50S， 52℃ 退火50S， 72℃ 延伸 2min， 30 個(gè)循環(huán)； 72℃ 延伸 10min。 引物 1 27F： 5’AGAGTTTGATCATGGCTCAG3’ 引物 2 1492R： 5’TACGGYTACCTTGTTACGACTT3’ 河南工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 14 表 25 PCR 反應(yīng)體系 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送交上海生工生物工程有限公司純化測(cè)序。 系統(tǒng)發(fā)育分析 將測(cè)序結(jié)果與 GenBank 數(shù)據(jù)庫中已有的 16S rDNA 序列進(jìn)行 BLAST 比對(duì)，并利用軟件 MEGA 構(gòu)建 NeighborJoining 系統(tǒng)發(fā)育樹。 結(jié)果與分析 細(xì)菌菌株的分離純化 采用稀釋分離法從不同的樣品中分離、純化得到細(xì)菌菌株 142 株，見表 26。 表 26 細(xì)菌菌株分離結(jié)果 樣品 菌株編號(hào) 菌株數(shù) LM07 LM0701LM0709 9 BH03 BH0301BH0311 11 BH04 BH0401BH0407 7 LM08 LM0801LM0805 5 LM19 LM1901LM1907 7 LM21 LM2101LM2108 8 LM23 LM2301LM2312 12 DT02 DT0201DT0204 4 DT05 DT0501DT0505 5 DT06 DT0601DT0606 6 DT18 DT1801DT1806 6 DT19 DT1901DT1909 9 DT21 DT2101DT2112 12 RST19 RST1901RST1910 10 SQ03 SQ0301SQ0305 5 DZ02 DZ0201DZ0208 8 DZ05 DZ0501DZ0509 9 DZ06 DZ0601DZ0609 9 ddH20 12μL 模板 1μL 引物 1 1μL 引物 2 1μL 2Taq Plus PCR Green Mix 15μL 總體系 30μL 廣譜高效微生物防腐劑產(chǎn)生菌的篩選及應(yīng)用 15 拮抗菌株初篩 采用濾紙片法或平板對(duì)峙培養(yǎng)法對(duì)分離純化得到的 142株細(xì)菌菌株進(jìn)行拮抗菌株的初步篩選，初步篩選得到具有抑菌效果的拮抗菌株 23 株，結(jié)果見表 27。菌株 BH040菌株 BH0403 及菌株 DZ0507 對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有抑制能力，對(duì)供試病原真菌無抑菌活性。菌株 LM210菌株 LM231菌株 L231菌株 DT0504 及菌株 DT2105 對(duì)供試病原真菌具有較好抑制能力，對(duì)細(xì)菌無抑菌活性。菌株 RST190菌株 DZ050菌株 DZ0605 及菌株 DZ0607 僅對(duì)絲狀真菌具有較強(qiáng)的抑制能力。其中菌株 LM230 菌株 DT210 菌株 RST190 菌株 DT180 菌株 DT180 菌株 DZ020 菌株 DZ0503 對(duì) 7 株供試病原菌具有廣譜拮抗效果，故選取這 7 株細(xì)菌進(jìn)行拮 抗菌株的復(fù)篩。 拮抗菌株復(fù)篩 將初篩得到的 7 株拮抗菌株發(fā)酵培養(yǎng) 48h 后，經(jīng)離心過濾得到其無細(xì)胞培養(yǎng)濾液，采用牛津杯法測(cè)定 7 株拮抗菌株無細(xì)胞培養(yǎng)濾液的抑菌能力，結(jié)果見表28，利用 SAS 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。綜合比較初篩及復(fù)篩結(jié)果可知，菌株LM2303 廣譜拮抗效果最好，故選取菌株 LM2303 進(jìn)行后續(xù)研究。菌株 LM2303及其無細(xì)胞培養(yǎng)濾液對(duì)有害微生物的抑制作用如圖 21 和圖 22 所示。 表 28 拮抗菌株復(fù)篩結(jié)果 菌株 抑菌帶寬 /mm LM2303 177。 177。 6177。 177。 177。 177。 177。 RST1902 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 DT2101 5177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 DT1805 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 DT1806 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 DZ0206 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 DZ0503 177。 177。 177。 177。 177。 177。 177。 注：字母代表在 p 水平上具有顯著性差異。 河南工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文 16 表 27 拮抗菌株初篩結(jié)果 拮抗菌株 指示菌 BH0401 + + BH0403 + + LM1902 ++ ++ LM2105 + + + + + LM2107 + ++ ++ DZ0507 + + LM2303 ++ ++ ++ ++ +++ +++ +++ LM2307 + + LM2311 + + + + + LM2312 + + + + + DT0504 + + + + + DT1805 + + + + + ++ ++ DT1806 + + + + + ++ ++ DT2101 + + + ++ ++ +++ +++ DT2105 + + + ++ ++ DT2109 + + RST1902 + + + + ++ +++ +++ RST1907 ++ ++ DZ0206 + + + + + +++ +++ DZ0503 + + + + + ++ ++ DZ0509 ++ ++ DZ0605 ++ ++ DZ0607 ++ ++ 注