疫學(xué)檢測技術(shù)ppt課件(2)-資料下載頁
2025-01-15 05:22本頁面
【正文】 這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性．又保留酶的活性。 二、基本操作流程 測定抗原常用雙抗體夾心法，測定抗體用間接法。 基本過程 為： 固相包被（吸附已知成分、洗滌、封閉、洗滌） 加待測樣品 促反應(yīng) 洗滌 加酶結(jié)合物 促反應(yīng) 洗滌 加酶底物 促反應(yīng) 終止反應(yīng) 測定（比色、熒光） ? ELISA的類型： ? ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。用于這些目的的檢測方法主要有以下幾種類型。 1 雙抗體 (原 )夾心法 2 間接法 3 競爭法 4 雙位點一步法 5 捕獲法測 IgM抗體 6 應(yīng)用親和素和生物素的 ELISA ELISA的類型 ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要的試劑： （ 1）固相的抗原或抗體，即 免疫吸附劑 （ immunosorbent） ； （ 2）酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為 結(jié)合物 （ conjugate） ； （ 3）酶反應(yīng)的底物。 可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。 夾心法 過程：包被 加待測樣品 洗滌 加酶標(biāo)記物 洗滌 加底物 測定 1）雙抗體夾心法測抗原 此法適用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原（二價及以上），例如 HBsAg、 HBeAg、 AFP等。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。 2）雙抗原夾心法測抗體 用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗 HBsAg的檢測常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。 間接法測抗體 1）間接測抗體法 傳染病的診斷。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。 2）間接測抗原法 雙位點一步法 測定抗原 由雙抗體夾心改進(jìn)而來，將雙抗體夾心中針對同一抗原決定簇的 2種抗體改為針對抗原不同決定簇的 2種單抗。敏感性和特異性大為提高。 但抗原過量， Ag分別與固相抗體和酶標(biāo)抗體結(jié)合，抑制夾心復(fù)合物形成，出現(xiàn)所謂鉤狀效應(yīng)，甚至假陰性結(jié)果。 過程： Ab1包被 加待測樣品和酶標(biāo) Ab2 洗滌 底物 也可用雙抗原夾心測抗體 競爭法測抗體 過程：將待測抗體（原）同時加入包被孔，洗滌除去酶標(biāo)記物，加底物測定。 用于測定只有一個決定簇的小分子抗原或半抗原，當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠的純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。 競爭法測抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的 位點 ，因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，可以采用競爭法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。小分子激素、藥物等 ELISA測定多用此法。 競爭ELISA檢測 抗原 捕獲包被法測抗體或 IgM抗體捕捉 ELISA IgM的檢測常用于傳染病的診斷。用抗人 IgM抗體包被固相，以捕獲血清標(biāo)本中的 IgM（其中包括針對抗原的特異性 IgM抗體和非特異性的 IgM），再加抗原和酶標(biāo) 2抗。 此法常用于病毒性感染的早期診斷。 橋聯(lián)法 或稱抗酶抗體法或不標(biāo)記抗體酶法。常見的是HRP抗 HRP法， AP抗 AP法。 首先用酶（如 HRP）和抗原免疫同一種動物分別制備針對抗原和酶的抗體（ Ab1和 Ab3）；以制備 Ab1和 Ab3動物的 IgG免疫另一種動物，制備Ab2； Ab2與 Ab1和 Ab3反應(yīng)產(chǎn)生 Ab1 Ab2 Ab3復(fù)合物，其中 Ab2起橋梁作用；待測標(biāo)本含有與 Ab1相應(yīng)的抗原，反應(yīng)可生成 Ag Ab1 Ab2 Ab3 酶 復(fù)合物，加底物即可檢測。 過程： 已知抗體包被 加待測樣品，洗滌 加 Ab1，洗滌 加 Ab2，洗滌 加酶 酶抗體 底物 此外，目前比較流行的生物素、親和素、 SPA蛋白橋聯(lián)法用的比較多。 ABSELISA法 ① ：固相支持物； ②：樣品； ③：特異性 IgG； ④：生物素化抗小鼠 IgG （ Biotin）； ⑤：辣根過氧化物酶 HRP酶標(biāo)鏈親和素（ Avidin）； ⑥： DAB顯色液； ⑦：顯色； 其它酶聯(lián)免疫測定法 1）斑點免疫結(jié)合實驗 以硝酸纖維薄膜或尼龍膜做載體，操作與用聚苯乙烯相似。 2）酶聯(lián)免疫測定的放大系統(tǒng) ①生物素 親和素系統(tǒng)（ BAS） 利用一個親和素結(jié)合 4個生物素的特點，放大反應(yīng)效果。 ②酶聯(lián)免疫熒光測定（ ELFIA） 酶促反應(yīng)生產(chǎn)熒光物質(zhì)。靈敏度提高 1639倍，達(dá) 1015Mol/L。 ③ AKP放大系統(tǒng) 多種酶偶連和氧化還原反應(yīng)反復(fù)循環(huán)進(jìn)行。 3）均相 EIA 測定小分子抗原或半抗原，特別是藥物檢測。 測定模式是競爭抑制法。 分為 酶擴大免疫測定技術(shù)和克隆酶供體免疫測定 2種。 三、 標(biāo)本收集和保存 收集時間和體位影響 如做激素和藥物測定 外源性干擾 溶血、凝固不全、時間過長 內(nèi)源性干擾 補體、交叉反應(yīng)物質(zhì) 實驗前準(zhǔn)備 實驗物品、試劑、平衡溫度 加血清樣本和及反應(yīng)試劑 標(biāo)本稀釋、加樣順序和速度、加樣時間差 酶促反應(yīng) 混勻、溫度、反應(yīng)時間、 pH 洗板 加去污劑，手工或機械洗。 顯色 HRP的底物 OPD或四甲基聯(lián)苯胺（ TMB）。 37℃ 反應(yīng) 30 min。 比色 選擇正確的濾光片和波長、 OPD 492 nm， TMB 450 nm。有的儀器使用雙波長掃描，注意波長選擇。 結(jié)果判斷 定性用陰、陽性，定量則給出數(shù)據(jù)。
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