疫學(xué)檢測技術(shù)ppt課件(2)(參考版)
2025-01-18 05:22本頁面
【正文】 結(jié)果判斷 定性用陰、陽性，定量則給出數(shù)據(jù)。 比色 選擇正確的濾光片和波長、 OPD 492 nm， TMB 450 nm。 顯色 HRP的底物 OPD或四甲基聯(lián)苯胺（ TMB）。 分為 酶擴大免疫測定技術(shù)和克隆酶供體免疫測定 2種。 3）均相 EIA 測定小分子抗原或半抗原，特別是藥物檢測。靈敏度提高 1639倍，達 1015Mol/L。 2）酶聯(lián)免疫測定的放大系統(tǒng) ①生物素 親和素系統(tǒng)（ BAS） 利用一個親和素結(jié)合 4個生物素的特點，放大反應(yīng)效果。 過程： 已知抗體包被 加待測樣品，洗滌 加 Ab1，洗滌 加 Ab2，洗滌 加酶 酶抗體 底物 此外，目前比較流行的生物素、親和素、 SPA蛋白橋聯(lián)法用的比較多。常見的是HRP抗 HRP法， AP抗 AP法。 此法常用于病毒性感染的早期診斷。 競爭ELISA檢測 抗原 捕獲包被法測抗體或 IgM抗體捕捉 ELISA IgM的檢測常用于傳染病的診斷。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少，最后的顯色也愈淺。 競爭法測抗原 小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法的兩個以上的 位點 ，因此不能用雙抗體夾心法進行測定，可以采用競爭法模式。 過程： Ab1包被 加待測樣品和酶標(biāo) Ab2 洗滌 底物 也可用雙抗原夾心測抗體 競爭法測抗體 過程：將待測抗體（原）同時加入包被孔，洗滌除去酶標(biāo)記物，加底物測定。敏感性和特異性大為提高。間接法的優(yōu)點是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測相應(yīng)抗體的方法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備，應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同，尋找合適的標(biāo)記方法。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，因此其敏感度相對高于間接法。只要獲得針對受檢抗原的異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。 可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。 1 雙抗體 (原 )夾心法 2 間接法 3 競爭法 4 雙位點一步法 5 捕獲法測 IgM抗體 6 應(yīng)用親和素和生物素的 ELISA ELISA的類型 ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。 基本過程 為： 固相包被（吸附已知成分、洗滌、封閉、洗滌） 加待測樣品 促反應(yīng) 洗滌 加酶結(jié)合物 促反應(yīng) 洗滌 加酶底物 促反應(yīng) 終止反應(yīng) 測定（比色、熒光） ? ELISA的類型： ? ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。 ? （ 1）使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性； ? （ 2）使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性．又保留酶的活性。 ? 酶免疫技術(shù)按目的 分類 ? （一）酶免疫組織化學(xué)測定技術(shù) ? （二）酶免疫測定技術(shù) Ab *＋ Ag → Ab*Ag ＋ Ab* Ab ＋ Ag * → AbAg * ＋ Ag* （ 1） Homogenous （均相測定） （ 2） Heterogenous（異相測定） —— Solid phase —— liquid phase 第四節(jié) 酶聯(lián)免疫檢測技術(shù) ? 一、 ELISA的基本原理 ? ELISA(EnzymeLinked immunosorbent assay)的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。 封閉 封閉試劑濃度不能過高過低。倒干 PBS后，加入底物工作液，避光顯色 10分鐘，觀察顏色變化。C孵育 1小時。 5. 探針結(jié)合：封閉結(jié)束后，用 PBS漂洗一次。 如果有，可用另一份繼續(xù)以下的實驗。 3. 電轉(zhuǎn)移結(jié)束后，打開夾板，剪下 NC膜左右上角做標(biāo)記（即標(biāo)記有蛋白結(jié)合面）。當(dāng)前多采取化學(xué)顯色反應(yīng)。今天采取浸泡式電轉(zhuǎn)移。 一、原理： 蛋白質(zhì)組分經(jīng) SDSPAGE分離后，平行轉(zhuǎn)移到固相支持體（ NC膜或 PVDF膜）上，通過免疫試劑來檢測靶蛋白。簡單、快速、經(jīng)濟。 常見于抗體濃度過高、切片粘貼不牢，邊沿松動等 第三節(jié) 免疫印跡技術(shù) 1979年 Renart and Towbin 將 Southern blotting 技術(shù)應(yīng)用與蛋白質(zhì)研究，并與酶免疫技術(shù)結(jié)合建立的蛋白檢測技術(shù)。 操作失誤 嚴(yán)格按操作規(guī)程作。 組化染色的假陰性 標(biāo)本保存不當(dāng) 老舊標(biāo)本、固定不當(dāng)或固定時間太長、溫度過高等，改善條件，重做。 制片不當(dāng) 壞死、變性、炎癥組織、切片拱起、皺縮、邊沿缺損等。 洗滌不充分 加去污劑等洗。 抗體原因 抗體不純或標(biāo)本含與靶抗原類似的表位。 五、免疫組化的影響因素與對策 非特異性著色 由內(nèi)源性酶和生物素干擾 滅活酶，用親和素飽和生物素。要求 2種抗原分布于細(xì)胞不同部位。 免疫化學(xué)染色 酶法染色 免疫熒光染色 標(biāo)本處理 —熒光試劑 —封片觀察 一般為冰凍切片，石蠟切片效果差。 ⑥切片不能馬上染色的可晾干低溫冷藏，或置組織培養(yǎng)液內(nèi)。 ③及時清除殘余的包埋劑，防止撕裂組織。 ? ④調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細(xì)胞密集的薄切，纖維多細(xì)胞稀的可稍為厚切，一般在 5～ 10um間。小組織的應(yīng)先取一支承器，滴上包埋劑讓其冷凍，形成一個小臺后，再放上細(xì)小組織，滴上包埋劑。 組織標(biāo)本 組織標(biāo)本 冰凍切片操作方法及技術(shù)要點： ? ①取材，未能固定的組織取材，不能太大太厚，厚者冰凍費時，大者難以切完整，最好為24 24 2mm。 四、基本操作過程 全過程為：抗原制備與純化；抗體制備；標(biāo)記抗體制備；標(biāo)本采集與制備；免疫組化反應(yīng)與現(xiàn)色；結(jié)果觀察與分析。 現(xiàn)色系統(tǒng) 主要有 DA
教學(xué)課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1