westernblot專題ppt課件-資料下載頁
2025-01-14 03:57本頁面
【正文】 Western Blot ? 條帶比正常的窄？ ? “ 微笑 ” 或 “ 倒微笑 ”條帶？ ? 凝膠聚合不均勻，灌膠時候盡量混合均勻，動作輕緩 ? 拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲 ? 樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶導(dǎo)致寬窄不一，純化樣品，調(diào)整鹽濃度 ? 膠板底部有氣泡會影響電泳效果，應(yīng)趕走氣泡。同時注意電泳槽裝置是否合適 SDSPAGE電泳 Western Blot 轉(zhuǎn)膜及抗體檢測 ? 凝膠腫脹或卷曲？ ? 條帶歪斜或漂移？ ? 單個或多個白點？ ? 轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱 ？ ? 可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡 510min ? 電轉(zhuǎn)儀長期使用導(dǎo)致海綿變薄，“三明治”結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致?？稍趦蓧K海綿之間墊上少許普通的草紙 ? 確保膜和膠塊之間沒有氣泡 ? 緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過程注意降溫 Western Blot 轉(zhuǎn)移到膜上的蛋白很少 1. 蛋白分子量 10KD 2. 蛋白的等電點 9 3. SDS濃度不合適 4. 凝膠太厚 原因 對 策 1. 蛋白分子量 10KD時，減少轉(zhuǎn)膜時間；使用小孔徑的膜 2. 更換高 pH值 Buffer 3. 在陰極 buffer中加入 % SDS 可提高轉(zhuǎn)膜效率 4. 延長轉(zhuǎn)膜時間 Western Blot 1. 膜沒有均勻浸濕 2. 膜或者緩沖液污染 3. 封閉不充分 4. 抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng) 5. 抗體濃度過高 原因 對 策 1. 轉(zhuǎn)膜前用 100%甲醇將膜完全浸濕 2. 拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液 3. 檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng) 4. 雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度 背景太高 Western Blot 雜交信號很弱 1. 抗體保存不當(dāng) 2. 抗原不充足 3. 膜的漂洗過度 原因 對 策 1. 抗體長期保存應(yīng)在－ 70℃，使用前做效價檢測 2. 增加蛋白上樣量，做已知標準量蛋白的對照 3. 減少漂洗的時間和次數(shù) Western Blot 1. 一抗不是唯一特異的 2. 二抗出現(xiàn)非特異結(jié)合 原因 對 策 1. 制備單克隆抗體或者重新選取合成抗原多肽的位點 2. 設(shè)立不加一抗，只加二抗的平行對照來檢測二抗是否有非特異結(jié)合 出現(xiàn)非特異帶 Western Blot Further Readings ? 生物秀 Western Blotting專題 ? ? Millipore的蛋白印跡手冊 ? ? BioRad的 western Blotting操作手冊 ? ? Western blot問題解答專帖 ? 謝謝大家！
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