【正文】 、固液比、超聲破碎時(shí)間、丙酮為四個(gè)因素，選取三個(gè)水平做正交試驗(yàn)，見 表 14，表 15。鹿胎提取液的多肽含量作為正交試驗(yàn)結(jié)果的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。正交試驗(yàn)重復(fù) 3 次，多肽含量平均值見表 16。 應(yīng)用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ (共享版 )軟件第 1 章 CPIRF 制備條件優(yōu)化 11 對正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析見圖 11 和圖 12。其中 圖 11 是正交試驗(yàn)直觀分析，從極差值可以看出四個(gè)因素，超聲功率 丙酮 超聲時(shí)間 固液比。正交試驗(yàn)四因素中，超聲功率是主要因素。 表 1 6 正交試驗(yàn)多肽含量 （ n=3， x177。s） 序號 平均 OD 值 鹿胎盤提取液多肽含量 (mg/ml) 1 177。 2 177。 3 177。 4 177。 5 177。 6 177。 7 177。 8 177。 9 177。 表 1 7 正交試驗(yàn) 結(jié)果 序號 超聲功率（ w） 固液比（ W:V） 超聲時(shí)間（ s） 丙酮（ V:V） 提取液多肽含量（ mg/ml） 1 200 1:1 60 1:2 2 200 1:2 90 1:3 3 200 1:3 120 1:4 4 300 1:1 90 1:4 5 300 1:2 120 1:2 6 300 1:3 60 1:3 7 400 1:1 120 1:3 8 400 1:2 60 1:4 9 400 1:3 90 1:2 軟件分析正交試驗(yàn) 用 正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ (共享版 )軟件 分析正交試驗(yàn)結(jié)果。直觀分析結(jié)果見圖 11，四因素效應(yīng)曲線圖見圖 12。 第 1 章 CPIRF 制備條件優(yōu)化 12 圖 1 1 正交試驗(yàn) 直觀分析 圖 1 2 正交試驗(yàn)四因素效應(yīng)曲線圖 提取液多肽含量 第 1 章 CPIRF 制備條件優(yōu)化 13 圖 1 3 正交 試驗(yàn) 四因素分析圖 以 四因素多肽含量的均值 (R1, R2, R3) 為縱坐標(biāo)，四因素為橫坐標(biāo)做圖，結(jié)果見圖 13。結(jié)果表明，超聲功率為 400 w 時(shí)，多肽含量最高（均值 R3）；固液比 1:2時(shí)多肽含量最高；隨著超聲提取時(shí)間的增長，多肽含量增加，提取時(shí)間為 120 s 時(shí)，多肽含量最高；丙酮含量表明，提取液 :丙酮比值為 1:3 時(shí)，效果 最好。根據(jù)單因素分析最佳組合為超聲功率 400 w、 固液比 1: 提取時(shí)間 120 s、 提取液 :丙酮比值為1:3。 正交試驗(yàn)最佳 條件為 超聲功率 400 w、固液比 1:超聲時(shí)間 120 s、丙酮量 1:3（提取液 :丙酮） 。實(shí)驗(yàn) 結(jié)果 與理論 組合 相比， 四因素中 固液比不同。由于四因素中固液比影響最小， 且固液比三組數(shù)據(jù)間無顯著性差異， 因此固液比選擇 1:1。 正交試驗(yàn)確定的最佳提取條件為 超聲功率 400 w、固液比 1:超聲時(shí)間 120 s、丙酮量 1:3。 紫外特征峰檢測 圖 1 4 CPIRF 紫外特征峰檢測 2 3 . 9 0 2 3 . 9 42 3 . 2 82 2 . 4 22 2 . 4 82 5 . 4 32 6 . 4 92 5 . 0 92 6 . 3 02 5 . 5 62 4 . 8 92 8 . 0 80 . 0 05 . 0 01 0 . 0 01 5 . 0 02 0 . 0 02 5 . 0 03 0 . 0 0u l t r a so n i c p o w e r （ w ） so l i d l i q u i d r a t i o ( W : V ) e x t r a ct i o n t i m e ( s) a m o u n t o f a ce t o n e ( V : V )Polypeptide content（mg/ml）R1R2R3第 1 章 CPIRF 制備條件優(yōu)化 14 所制備的 鹿胎 免疫 調(diào)節(jié) 因子紫外吸收 峰 集中在 200300 之間，其最大吸收峰 nm（ 圖 14） 。 小結(jié) 研究表明，胎盤免疫調(diào)節(jié)因子或胎盤因子、胎盤免疫調(diào)節(jié)肽或胎盤肽，是通過透析或超濾從胎盤中提取的具有免疫功能的活性成分。 人胎盤紫外吸收峰 260 nm[50]或 254258 nm[51]或 250260 nm[52]。 周國華制備的牛、羊和豬胎盤肽的紫外最高吸收峰分別為 nm、 nm 和 nm[53]。 胎盤 不同，紫外吸收峰不同，從整體范圍上看均為 200260 nm。 本章用 超聲功率、固液比、超聲時(shí)間、丙酮量為四因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn) 。 其中 超聲功率影響最大，丙酮量和超聲時(shí)間其次，固液比影響最小。以鹿胎盤提取液多肽含量為指標(biāo)，確定最優(yōu)化制備條件為：超聲功率 400w、固液比 1:超聲時(shí)間 120 s、丙酮量 1:3（提取液 :丙酮）。之后利用透析（或超濾）方法制備得到微黃色 透明液體的 CPIRF。 紫外掃描表明， CPIRF 紫外最高吸收峰為 nm，與報(bào)道的動(dòng)物胎盤紫外吸收峰比較接近。 通過本章研究，明確 CPIRF 的制備條 件，并 成功獲得了CPIRF。 第 2 章 CPIRF 主要成分分析 15 第 2 章 CPIRF 主要成分分析 實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 胎盤中主要含有多肽、多糖、核酸等活性物質(zhì)。 本章利用生化試驗(yàn)方法 對 CPIRF多肽、多糖、核酸含量的測定，明確 CPIRF 中 主要成分。 實(shí)驗(yàn)方案 人胎盤研究表明，人 胎盤免疫調(diào)節(jié)因子是從健康孕婦足月分娩的胎盤中分離提取的小分子多肽及核酸為主的混合物質(zhì)。 研究證實(shí) 鹿胎盤 中 含有蛋白質(zhì)（免疫球蛋白、尿激酶、溶菌酶）、多肽（如鹿胎免疫調(diào)節(jié)因子等多種因子）、促性腺激素、催乳素、多糖、多種礦物元素、氨基酸和維生素等。 為進(jìn)一步測定 CPIRF 主要成分，這一章 采 用 Folin酚法，牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定胎盤提取液中多肽含量 ； 采用苯酚 硫酸法，葡萄糖作標(biāo)準(zhǔn)曲線，測定胎盤提取液中多糖含量 ； 采用 釩鉬酸銨顯色 法測定 CPIRF 中 總核酸 含量。 試驗(yàn) 材料 、 試劑 與儀器設(shè)備 試驗(yàn)材料 所用試驗(yàn)材料見表 11。 試驗(yàn)試劑 所用 主要試驗(yàn)試劑 見表 12。 儀器設(shè)備 所用儀器設(shè)備見表 13。 第 2 章 CPIRF 主要成分分析 16 基本實(shí)驗(yàn)方法 CPIRF 多肽含量分析 采用 Folin酚 法測定 CPIRF 多肽含量。 Folin酚法原理 多肽或 蛋白質(zhì)中含有酪氨酸和色氨酸殘基，能與 Folin酚試劑起氧化還原反應(yīng)。反應(yīng)過程分為兩步，第一步：在堿性溶液中， 多肽或 蛋白質(zhì)分子中的肽鍵與堿性銅試劑中的 Cu2+作用生成 多肽或 蛋白質(zhì) Cu2+復(fù)合物；第二步： 多肽或 蛋白質(zhì) Cu2+復(fù)合物中所含的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍(lán)色的化合物。該呈色反應(yīng)在 30 min 內(nèi)即接近極限，并且在一定濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺度與蛋白質(zhì)濃度呈線性關(guān)系，故可用比色的方法確定蛋白質(zhì)的含量。進(jìn)行測定時(shí)要根據(jù)蛋白質(zhì)濃度 的不同選用不同的測定波長：若 多肽或 蛋白質(zhì)含量高時(shí)（ 25100 μg）在 500 nm 波長處進(jìn)行測定，含量低時(shí) (525 μg)在 755 nm 波長處進(jìn)行測定。最后根據(jù)預(yù)先繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線求出未知樣品中 多肽或 蛋白質(zhì) 含量。 Folin酚試劑法操作簡便，靈敏度高，樣品中 多肽或 蛋白質(zhì)含量高于 5 μg 即可測得，是測定 多肽或 蛋白質(zhì)含量應(yīng)用得最廣泛的方法之一。 Folin酚法 操作步驟 1）牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：精確稱取 g 牛血清白蛋白，用少量蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)入 100 ml 容量瓶中，定容至 100 ml，配成 250 μg/ ml 的牛血清白蛋白溶液。取六支普通試管，按表 17 加入標(biāo)準(zhǔn)濃度的牛血清白蛋白溶液和蒸餾水。然后加試劑甲 5 ml，混合后在室溫下放置 10 min， 再加入 ml 試劑乙，立即混合均勻。 30 min 后，以一號管為對照，用 721 型可見光分光光度計(jì) 500 nm 波長下測定各試管中溶液的光密度并記錄結(jié)果。 2） 蛋白質(zhì)含量的測定：取提取液 ml，加蒸餾水到 1 ml，加試劑甲 5 ml，混合后在室溫下放置 10 min，再加 ml 試劑乙，立即混合均勻。 30 min 后以一號管為對照 ，用可見光分光光度計(jì)于 500 nm 波長下測定光密度并記錄結(jié)果。根據(jù)牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出 CPIRF 中多肽 含量。 第 2 章 CPIRF 主要成分分析 17 表 2 1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 試 劑 管 號 1 2 3 4 5 6 250 μg/ml BSA（ ml） 0 蒸餾水（ ml） 0 蛋白質(zhì)含量（ μg） 0 50 100 150 200 250 CPIRF 多糖含量分析 采用 苯酚 硫酸法測定 CPIRF 中多糖含量。 苯酚 硫酸法原理 苯酚 硫酸可與游離的寡聚多糖中的已糖、糖醛酸（或甲苯衍生物）起顯色反映，已糖在 490 nm 處有最大吸收值，一定范圍內(nèi)吸收值與已糖含量呈線形關(guān)系。用 721 型可見光分光光度計(jì) 490 nm 處測定不同濃度葡萄糖吸光度值，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的吸光度值計(jì)算得到樣品中多糖含量。 苯酚硫酸法操作步驟 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：稱取葡萄糖（ 105oC 干燥 2 h） 50 mg， 定容至 500 ml，按照表 18 加入標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液和蒸 餾水。再向試管內(nèi)加入 5%苯酚 ml，搖勻后加入 ml 濃硫酸，室溫放置 30 min， 于 490 nm 處測定 OD490，以 1 號管按同樣條件加苯酚和濃硫酸做空白對照，試驗(yàn)結(jié)果見表。 5%苯酚溶液的配制：準(zhǔn)確稱取 5 g苯酚，加蒸餾水定容至 100 ml，用棕色玻璃瓶密封保存（此溶液存放時(shí)間不宜太長） 。根據(jù)表 22，制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。 表 2 2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 試 劑 管 號 1 2 3 4 5 6 100 μg/ml 葡萄糖（ ml） 0 蒸餾水（ ml） 0 葡萄糖含量（ μg） 0 20 40 60 80 100 第 2 章 CPIRF 主要成分分析 18 CPIRF 核酸 含量分析 采用 釩鉬酸銨顯色 法 [54]測定 CPIRF 中 總 核酸 含量。 釩鉬酸銨顯色法原理 核酸分子中含有一定比例的磷，且含量比較接近和恒定，測定此磷的量，即可求得核酸的量。用強(qiáng)酸使核酸分子中的有機(jī)磷消化成無機(jī)磷，與釩 鉬酸銨反應(yīng)，生成黃色（ NH4） 3PO4NH4VO316MoO3 物質(zhì)，在酸性溶液中 420 nm 處進(jìn)行比色測定。 釩鉬酸銨顯色法操作步驟 1) 釩 鉬酸銨顯色劑：稱取偏釩酸銨 g，加硝酸 250 ml，另取鉬酸銨 25 g，加蒸餾水 400 ml 溶解。在冷卻條件下將此溶液倒入上溶液中，且加蒸餾水調(diào)成 1000 ml，避光保存，如生成沉淀則不能使用； 2) 高氯酸 鉬酸銨沉淀劑： 14 ml HClO4 加 1 g 鉬酸銨以水定容至 400 ml。 3) 標(biāo)準(zhǔn)磷溶液：將磷酸二氫鉀于 110oC 烘干恒重，準(zhǔn)確稱取 g 溶于少量蒸餾水中，轉(zhuǎn)移至 ml 容量瓶中，加入硝酸 5 ml，用蒸餾水稀 釋至刻度。此溶液每毫升含磷 400 μg。 臨用時(shí)準(zhǔn)確稀釋至 100 μg/ml， 20 μg/ml。 4) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取 、 、 、 、 、 、 、 ml磷標(biāo)準(zhǔn)溶液（ 100 μg/ml），分別置 ml 比色管中，加 ml 顯色劑，用水定容至刻度，搖勻，在室溫下放置 20 min， 1 cm 比色杯比色，以試劑空白溶液調(diào)零，在波長 420 nm 處測吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，磷的含量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。 5) 樣品測定 ：總核酸的測定 ，稱取均勻的 樣品（含磷約 1~10 mg） 于消化管中，加入 15 ml 硝酸，小火消化至無棕色煙后， 冷卻后加高氯酸 ml，大火加熱，待有大量白煙 冒出，溶液變無色或淡黃色約 3~5 ml，加少量水煮沸，冷卻后以水定容至 ml。取 ml 消化液加 ml 釩鉬酸銨顯色劑，定容至 ml。穩(wěn)定20 min 在 420 nm 處測定吸光度。在標(biāo)準(zhǔn)曲線上 找出對應(yīng)磷的含量，以此求出相應(yīng)的核酸含量。 6) 無機(jī)磷空白測定：取樣品適量，以水定容至 ml，搖勻，取 ml 樣品溶液加 ml 沉淀劑， 靜置 30 min，離心，取上層清液 ml 加顯色劑 ml，在 420 nm 處比色測定。 7) 無機(jī)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線：取 、 、 、 、 ml