【正文】 分類號(hào)： 單位代碼： 10140 密 級(jí)： 公開 學(xué) 號(hào)： 403071289 碩 士 學(xué) 位 論 文 梅花鹿胎盤免疫調(diào)節(jié)因子及 其 體外活性研究 論文題目： Bioactivity Assay of Cervine Placental Immune Regulator Factor In Vitro 英文題目： 論文作者： 邊 媛 媛 指導(dǎo)教師： 胡風(fēng)慶 教授 專 業(yè)： 食 品 科 學(xué) 完成時(shí)間： 二 O 一 O 年 五 月 申請(qǐng)遼寧大學(xué) 碩 士學(xué)位論文 梅花鹿胎盤免疫調(diào)節(jié)因子及 其 體外活性研究 Bioactivity Assay of Cervine Placental Immune Regulator Factor In Vitro 作 者： 邊 媛 媛 指導(dǎo)教師： 胡風(fēng)慶 教授 專 業(yè)： 食 品 科 學(xué) 答辯時(shí)間： 二 O 一 O 年 五 月 二○ 一 ○年 五 月中國(guó)遼寧 遼寧大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下 獨(dú)立完成的。論文中取得的研究成果除加以標(biāo)注的內(nèi)容外，不包含其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，不包含本人為獲得其他學(xué)位而使用過(guò)的成果。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體均已在文中進(jìn)行了標(biāo)注，并表示謝意。本人完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。 學(xué)位論文作者簽名： 年 月 日 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交學(xué)位論文的原件、復(fù)印件和電子版，允許學(xué)位論文被查閱和 借閱。本人授權(quán)遼寧大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編學(xué)位論文。學(xué)校須按照授權(quán)對(duì)學(xué)位論文進(jìn)行管理，不得超越授權(quán)對(duì)學(xué)位論文進(jìn)行任意處理。 保密（ ），在 年后解密適用本授權(quán)書。（保密：請(qǐng)?jiān)诶ㄌ?hào)內(nèi)劃“√”） 授權(quán)人簽名： 指導(dǎo)教師簽名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日摘 要 I 摘 要 現(xiàn)代研究證明，鹿胎盤含有多種蛋白質(zhì) 、激素、酶類 、抗體、磷脂、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子及能刺激 機(jī) 體免疫系統(tǒng)的小分子活性物質(zhì) 等 ，具 有 抗腫瘤、 增強(qiáng)抵抗力 和提高機(jī)體 免疫力 等 作用 ，在臨床 可替代人胎盤 ，具有 巨大 應(yīng)用 潛力 。本研究以梅花鹿胎 盤為原料，通過(guò)透析、超濾等技術(shù)制備具有生物活性的小分子活性物質(zhì) —— 鹿胎免疫 調(diào)節(jié) 因子 （ cervine placental immune regulator factor, CPIRF） 。 通過(guò)正交試驗(yàn) ，對(duì) 超聲功率、固液比、超聲時(shí)間、丙酮量等因素 進(jìn)行優(yōu)化 ，確定最優(yōu)化的條件。 利用 鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)、 Ea 玫瑰花環(huán)試驗(yàn)評(píng)價(jià)其免疫活性 ， 利用 MTT 法評(píng)價(jià)其抑瘤活性。 研究 結(jié)果如 下： （ 1） CPIRF 制備 條件 優(yōu)化： 以超聲功率、固液比、超聲時(shí)間、丙酮量為四因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)， 結(jié)果表明： 超聲功率影響最大， 丙酮量 和 超聲時(shí)間 其次， 固液比影響最小。 以鹿胎盤提取液多肽含量為指標(biāo) ， 確定 最優(yōu)化制備條件為 ： 超聲功率 400 w、固液比 1:超聲時(shí)間 120 s、丙酮量 1:3（ 提取液 :丙酮 ） 。 之后利用 透析（或超濾）方法 制備得到 微黃色透明液體 的 CPIRF。 （ 2） CPIRF 成分 分析 ： 利用 Folin酚法 、苯酚 硫酸法、釩鉬酸銨顯色法分別測(cè)定 CPIRF 中的 多肽 、 多糖 和 核酸含量 。 結(jié)果表明： CPIRF 含有 177。 mg/ml多 肽 ， 177。 μg/ml 核酸， 177。 mg/ml 多糖 。 （ 3） 免疫活性 評(píng)價(jià) ： 利用 鼠脾淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 、 Ea 玫瑰花環(huán)試驗(yàn) 評(píng)價(jià) CPIRF免疫 活性。 在 4 μg/ ng/ml， 具有 鼠脾淋巴細(xì)胞增殖活性 。 當(dāng) 40 ng/ml 時(shí) ，增殖率 可達(dá) %。 Ea 玫瑰花環(huán)試驗(yàn) 具有濃度依賴性， 4 μg/ml 時(shí) ， Ea 玫瑰花環(huán) 成環(huán)率 最高 ，達(dá) 47%。 結(jié)果 表明 ， CPIRF 具有良好的免疫調(diào)節(jié)和免疫增強(qiáng)作用 。 （ 4）體外抑瘤活性評(píng)價(jià)： 以 MTT 法 評(píng)價(jià) CPIRF 對(duì) 宮頸癌 Hela 細(xì)胞株和大腸癌 CX1 細(xì)胞株的 體外抑瘤活性。 CPIRF 可顯著抑制 Hela 細(xì)胞株 和 CX1 細(xì)胞株 的生長(zhǎng)， 最佳抑瘤濃度為 4 ng/ml， Hela 細(xì)胞株和 CX1 細(xì)胞株的 抑瘤率分別為 %和 %， 表明 CPIRF 具有較強(qiáng)的體外抑瘤活性。 綜上所述，本研究 通過(guò) 制備條件 優(yōu)化 ， 獲得 具有抗腫瘤活性和免疫活性的CPIRF。該 制備 條件 簡(jiǎn)單， 所得到的 CPIRF 很好的 保持 了 原有 生物學(xué) 活性 ，有利于開發(fā)高 附加值功能食品和藥品。 這 為 解決當(dāng)前鹿產(chǎn)品 生產(chǎn) 中 存在的 加工粗糙 、產(chǎn)品初級(jí)、種類單一 等問(wèn)題 ， 提供了科學(xué)依據(jù)，該研究對(duì)于 鹿產(chǎn)業(yè)鏈的形成、發(fā)展 、壯大，促進(jìn)鹿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展 具有重要意義 。 關(guān)鍵詞 ： 梅花鹿胎盤，免疫調(diào)節(jié)因子 ， 正交試驗(yàn) ， 制備條件， 生物學(xué)活性Abstract II ABSTRACT Recent researches showed that cervine placenta contained many positions including proteins, hormones, enzymes, antibodies, phospholipids, growth factors, cytokines and small molecules which could stimulate immune system. Cervine placenta possessing the functions including antitumor, enhancing resistance and immunity could be used to substitute human placenta in clinic and had greatly applicable potentiality. Cervine placenta used as raw material, in this study, bioactive small molecules, cervine placental immune regulator factor (CPIRF), were preparated through dialysis or ultrafiltration. The conditions were optimized through orthogonal experiment. The major factors, including the ultrasonic power, solidliquid ratio, extraction time and the amount of acetone, were confirmed. Immune activity of CPIRF was evaluated through mouse spleen lymphocyte proliferation and Earosette test. Antitumor activity was evaluated through MTT method. The results were as follows: (1) The optimum conditions of CPIRF preparation: The orthogonal experiment was studied so as to confirm the factors including ultrasonic power, solidliquid ratio, extraction time and the amount of acetone. Influence of ultrasonic power was the greatest, extraction time and amount of acetone were next, and was solidliquid ratio less important according to results of orthogonal experiment. The optimized conditions were confirmed according to polypeptide content. The conditions included ultrasonic power 400 w, solid to liquid ratio 1:1, extraction time 120 s, amount of acetone 1:3 (extracting liquid/ acetone). After that, CPIRF further prepared through dialysis/ ultrafiltration method was slightly yellow and transparent liquid. (2) Analysis of CPIRF position: The folinphenol method, phenolsulfuric acid and ammonium vanadium coloration method were respectively used to determine peptides, polysaccharides and nucleic acid. Results showed that CPIRF contained 177。 mg/ ml peptide, 177。 μg/ ml nucleic acid and 177。 mg/ ml polysaccharide. (3) Assay of immune activity: Immune activity of CPIRF was evaluated through mouse spleen lymphocyte proliferation and Earosette test. Mouse spleen lymphocyte was proliferated between ngml and 4 μgml. The growing rate was up to % when CPIRF was 40 ngml. Ea rosette test was concentrationdependent, 47% of Ea rosettes rate was the highest when CPIRF was 4 μg/ml. Results showed that CPIRF had good Abstract III functions of immune regulation and enhancing immune activity. (4) Evaluation of antitumor activity in vitro: Antitumor activity of CPIRF on cervical cancer Hela cells and colorectal cancer CX1 cells in vitro was evaluated through MTT method. CPIRF significantly inhibited the growth of Hela cells and CX1 cells when CPIRF was 4 ng/ ml, growth inhibition of CPIRF on Hela and CX1 were respectively % and %, indicating that CPIRF had strong antitumor activity in vitro. In summary, CPIRF, possessing antitumor activity and immune activity, was prepared through the optimized conditions, which was simple and high efficient. CPIRF maintained the original bioactivity, which will help to research and develop high valueadded functional food or medicine. It will help to solve the problems of crudely processing, primary and single products, which have great signi