【正文】 ge antibody library)技術(shù) 定義： 通過 PCR將全套人抗體重鏈和輕鏈V區(qū)基因克隆出來，并在噬菌體表面表達(dá)、分泌，經(jīng)篩選后獲得特異性抗體。 噬菌體表面展示文庫技術(shù)的要點(diǎn) : 外源基因表達(dá)多肽以融合蛋白形式展示在外殼蛋白 N端 將基因組合文庫插入噬菌體編碼膜蛋白的基因 g3或 g8 的先導(dǎo)系列的緊靠下游 隨機(jī)克隆入相應(yīng)載體形成組合文庫 從免疫或未被免疫的 B細(xì)胞中 PCR擴(kuò)增抗體全套基因片段 用固相化抗原經(jīng) “ 親和結(jié)合一洗脫一擴(kuò)增 ” 數(shù)個(gè)循環(huán)直接、方便、簡捷、高效地篩選出表達(dá)特異性好、親和力強(qiáng)的抗體噬菌體庫。 使翻譯出的抗體分泌到細(xì)菌的周 質(zhì) 腔內(nèi)，形成游離的抗體片段，經(jīng)過純化即可獲得目的抗體。 篩選到的噬菌體再將基因 g3或 g8切除后，轉(zhuǎn)入大腸桿菌， 該項(xiàng)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn) : 將 抗體的基因型和表型緊密聯(lián)系 起來 。 可繞過雜交瘤技術(shù)，不需要復(fù)雜的基因工程技術(shù) 。 抗體基因篩選的范圍廣 。 技術(shù)穩(wěn)定、可靠、生產(chǎn)周期短 ?？梢?guī)模化生產(chǎn) 。 適用范圍廣，既可用于抗體制備，也適用于其它蛋白如激素、酶、藥物、隨機(jī)多肽等的生產(chǎn)。 不經(jīng)過細(xì)胞融合及動(dòng)物免疫等步驟 噬菌體抗體庫的分類 （ 一 ） 按抗體基因的性質(zhì)分 1. DNA文庫 2. cDNA文庫 （ 二 ） 按抗體基因的來源分 1． 天然抗體庫 (native antibody library) 2． 免疫抗體庫 3． 半合成抗體庫 4． 全合成抗體庫 用 SCID小鼠制備人單抗 SCID小鼠 移植入人淋巴細(xì)胞 （人鼠嵌合模型） 抗原免疫 雜交瘤技術(shù) 基因工程 人單抗 人抗體鼠 — 將小鼠 Ig基因滅活，然后轉(zhuǎn)入人 Ig基因，生產(chǎn)出人單抗 遺傳工程鼠 基因工程抗體真核細(xì)胞高效表達(dá)流程圖 單抗研發(fā)的演變歷程 鼠單抗 100% 鼠源 OKT3 Panorex Zevalin 鼠 /人崁合單抗 (6675 % 人源 ) ReoPro, Rituxan Remicade Simulect 人源化單抗 (9095 % 人源 ) Zenapax, Mylotarg, Herceptin, Campath Synagis 100% 人源 … 抗體在體外人源化存在的問題 ? 操作過程復(fù)雜 ? 需付出昂貴的代價(jià) ? 抗體的親和力降低 ? 抗體不是人體免疫系統(tǒng)天然產(chǎn)生 ? 異源抗體與免疫系統(tǒng)的配合 最理想的單克隆抗體 ?100%人源 ? 人類免疫系統(tǒng)自然產(chǎn)生 全人抗體的理論基礎(chǔ) ?癌癥細(xì)胞、病毒、細(xì)菌對(duì)人機(jī)體而言均為異己物 ?人體不斷受異己物攻擊，但免疫系統(tǒng)通常有清除能力 ?免疫系統(tǒng)通過體液免疫和細(xì)胞免疫對(duì)異己物做出反應(yīng) ?體液免疫就是針對(duì)異己物天然地產(chǎn)生抗體 全人抗體面臨的關(guān)鍵問題 ? 持續(xù)分泌抗體的人 B細(xì)胞 ? 抗體分泌細(xì)胞的保持 30年來的全人抗體的嘗試 ? 鼠骨髓瘤不適合與人 B細(xì)胞融合 穩(wěn)定性差 抗體產(chǎn)量低 ? 非洲淋巴細(xì)胞瘤病毒 (EBV) 保存抗體分泌細(xì)胞 細(xì)胞株不穩(wěn)定 抗體的產(chǎn)量低 不能特異性地保存抗體分泌細(xì)胞 ? 很難獲得人類骨髓瘤細(xì)胞株 全人抗體技術(shù)的最新突破 成功建立人骨髓瘤細(xì)胞系，人源抗體的研究進(jìn)入新的里程 ? 用途：能穩(wěn)定的保持人 B細(xì)胞分泌抗體的能力 ? 發(fā)明人：英國劍橋大學(xué)的 ? 意義： 1 在整體水平上研究人類產(chǎn)生的抗體 2 開創(chuàng)人類抗體基因組學(xué)的研究 ? 評(píng)價(jià)： 諾貝爾獎(jiǎng)得主 推薦發(fā)表 在 PNAS，世界權(quán)威雜志 “ 科學(xué) ” 發(fā)表了 新聞評(píng)述，劍橋大學(xué)開了新聞發(fā)布會(huì) 人－人雜交瘤技術(shù) ? 開發(fā)針對(duì)未知抗原的全人治療用抗體的唯一技術(shù) ? 分離、保存穩(wěn)定分泌天然抗體的 B細(xì)胞先進(jìn)方法。 ? 尋找新型腫瘤相關(guān)抗原的捷徑 人－人雜交瘤技術(shù)的優(yōu)勢(shì) （ 1）迅速高效的生產(chǎn)天然人類單克隆抗體 – 抗原選定和抗體產(chǎn)生都由人類免疫系統(tǒng)完成 ， – 不會(huì)引起自身免疫反應(yīng) ， 與人體免疫系統(tǒng)配合良好 – 能獲得最佳親和力和中和活性的抗體 – 更合理的自然選擇藥物設(shè)計(jì)方式 – 加速抗原的發(fā)現(xiàn)和抗體的開發(fā)過程 人－人雜交瘤技術(shù)的優(yōu)勢(shì) （ 2）簡便、低費(fèi)用的抗原抗體研究生產(chǎn)方式 – 與其他抗體改良技術(shù)相比操作更簡便 – 起始抗體分泌水平較高 ， 可直接用于工業(yè)規(guī)模生產(chǎn) – 避免了改良技術(shù)引起的抗體失活 – 無需發(fā)現(xiàn)抗原和對(duì)抗原進(jìn)行功能確定 人－人雜交瘤技術(shù)的優(yōu)勢(shì) （ 3）唯一研究全人抗體圖譜的技術(shù)。 – 確定人類免疫識(shí)別系統(tǒng) ， 確定人類免疫系統(tǒng)在不同的生理 、 病理以及發(fā)育條件下得到的抗體圖譜 。 （ 4） 研究癌癥免疫學(xué)和抗原基因組的最新技術(shù) 。 – 尋找人類癌癥抗原 ， 將找到的抗原作為癌癥疫苗和抗體藥物開發(fā)的靶標(biāo) 。 人－人雜交瘤技術(shù)的優(yōu)勢(shì) （ 5）開發(fā)針對(duì)已知抗原的第二代全人抗體產(chǎn)品，如 HERE2/neu, TNF,以及感染性疾病如乙型肝炎病毒 , HCV和 HIV （ 6） 與其他細(xì)胞融合 ， 產(chǎn)生雜交瘤 ， 制造其他有用的人類蛋白質(zhì) 。 未來單抗開發(fā)的完美方案 ? 從已知治療靶子生產(chǎn)高親和力全人抗體 ? 全人抗體挑戰(zhàn)靶分子的篩選 ? 開發(fā)未知抗原的治療用抗體 人 人雜交瘤技術(shù)的應(yīng)用 ： 抗肝癌單克隆抗體 抗乳腺癌單克隆抗體 抗肺癌單克隆抗體 抗結(jié)腸癌單克隆抗體 ： 乙型肝炎病毒單克隆抗體 丙型肝炎病毒單克隆抗體 艾滋病病毒單克隆抗體 治療乳腺癌曲妥珠單抗藥物 我國第一個(gè)基因重組人源化單克隆抗體藥物－泰欣生（尼妥珠單抗） 治療直腸、結(jié)腸癌的貝伐單抗 瑞士羅氏生產(chǎn)的安維汀 需要整合的技術(shù)平臺(tái) ? 蛋白組學(xué) – 蛋白芯片、 2維 電泳技術(shù) ? 免疫組學(xué) ? 組織信息學(xué) – 細(xì)胞陣列技術(shù) – 組織微陣列技術(shù) ? 人－人雜交瘤 人 人雜交瘤與腫瘤相關(guān)抗原 ? 癌癥免疫組學(xué) – 癌癥患者免疫反應(yīng)的全過程 – 癌癥抗原和抗體庫 ? SEREX – 重組 cDNA表達(dá)文庫血清分析 ? 確定可能作為癌癥疫苗的靶抗原 ? 確定能夠作為抗體靶向的抗原 ? 經(jīng)典方法認(rèn)識(shí)的腫瘤相關(guān)抗原再認(rèn)證 – HERE2/neu, CEA, AFP (甲胎球蛋白 ), MAGE, P53， CA125…… 腫瘤相關(guān)抗原制備的單克隆抗體的應(yīng)用 基因組、蛋白質(zhì)組和抗體組 基因組 蛋白質(zhì)組 抗體組 50,000 10 to 20 million 100 millions genes distinct proteins antibodies Antibodomics Proteomics Genomics 思考題 : ? 單克隆抗體的定義和它的不足 ? 基因工程抗體有那些類型 ? 如何制備雜交瘤細(xì)胞