【正文】 一、酸性微生物蛋白酶 （一）酸性蛋白酶的性質(zhì) 酸性蛋白酶廣泛存在于霉菌、酵母茵和擔子菌中，細菌中極少發(fā)現(xiàn)，其最適 pH 為 3～ 4，相對分子質(zhì)量 30 000～ 40 000，等電點低 (pH 3～ 5)。大多數(shù)酶在其活性中心含有兩個天冬氨酸殘基。酶蛋白中酸性氨基酸含量高，而堿性氨基酸含量低。 酸性蛋白酶在許多方面與動物胃蛋白酶和凝乳蛋白酶相似。常見的幾種酸性蛋白酶的性質(zhì)如表 55 所示。 酸性蛋白酶在 pH 2～ 6 范圍內(nèi)穩(wěn)定。若在 pH 7， 40℃，處理 30 min 立即失活。齋藤曲霉酸性蛋白酶，最適 pH 2～ 3，在 pH 的培養(yǎng)液中穩(wěn)定，但在 pH ， 30℃可引起嚴重的失活。從溶液中游離氨基氮的增加，可以看出酶的失活是由于自溶：在 pH 6～ 7 酶發(fā)生變性失活，添加 2mol/L NaCl 可以增加酶的穩(wěn)定性 。紫微青霉酸性蛋白酶最適 pH 為 ，而穩(wěn)定pH 為 。 一般霉菌酸性蛋白酶在 50℃以上頗不穩(wěn)定，齋藤曲霉酸性蛋白酶在 pH ， 50℃，黑曲霉 的酶在 pH ， 60℃處理 20min 可引起完全失話。但是紫微青霉酸性蛋白酶在60℃、杜邦青霉 Kl014 酸性蛋白酶在 60℃經(jīng)歷 1h 也不致失活，后者在 pH 的最適溫度為75～ 80℃。大孢子黑曲霉 (A. niger var. macrosporus DBD0406)酸性蛋白酶 A 的最適溫度為70℃。有些酸性蛋白酶不耐低溫，冰凍干燥時也會引起失活。許 多酸性蛋白酶分子中含有5％～ 10％多糖對酶穩(wěn)定有益。 (二）生產(chǎn)菌種 酸性蛋白酶在 1954 年首先由吉田在黑曲霉中發(fā)現(xiàn)。許多真菌酸性蛋白酶生產(chǎn)菌種已經(jīng)提純并進行了鑒定 (表 57)。商品酸性蛋白酶的生產(chǎn)菌種，主要有黑曲霉、黑曲霉大孢子變種、齋藤曲霉、根霉、杜邦青霉、血紅色陀螺孔霉和微小毛霉 (凝乳酶 )等少數(shù)菌株。 (三 )酸性蛋白酶的生產(chǎn)實例 國內(nèi)最先投產(chǎn)的酸性蛋白酶是采用黑曲霉 液體深層培養(yǎng)法進行生產(chǎn)，在毛皮軟化制革、羊毛染色、醫(yī)藥和啤酒澄清方面有廣泛用途。下面介紹其生產(chǎn)工藝技術(shù)。 1 工藝流程 (圖 57) 2．操作要點 (1)種子培養(yǎng)。將菌種接于 500 L 種子罐培養(yǎng)基中，于（ 31177。 1℃） 230r/min 下通風培養(yǎng)26h，通風量為 。 (2)發(fā)酵。 5000L 不銹鋼發(fā)酵罐裝 3 000L 培養(yǎng)基，于 (31177。 1) ℃ 180r／ min 下通風培養(yǎng)，控制通風量 0～ 24h 為 1:； 24～ 48h 為 1:； 48h 至結(jié)束為 1:，平均 1: VVm 左右。發(fā)酵 72h，酶活性一般達 2500～ 3200 U/m1。 (3)酶的 提取。工業(yè)用的粗制品酶采用鹽析法提取，將培養(yǎng)物濾去菌體，用鹽酸調(diào)節(jié)至 pH 以下，加入硫酸銨至終濃度 55％，靜置過夜，傾去上清液，沉淀壓濾去母液，于 40℃烘干后磨粉。鹽析工藝收率 94％以上，干燥后收率 60％以上，酶活性為 20 萬 U/g。也可將發(fā)酵液濾除菌體后，使用刮板式薄膜蒸發(fā)器 40℃濃縮 3～ 4 倍，直接作為商品。 (4)酶的純化。供醫(yī)藥和食品工業(yè)使用的酶通常要進一步純化。純化方法有以下兩種： ①離子交換法；將所得的粗酶加水浸泡 (pH )、過濾或直接將上述發(fā)酵液離心濾除菌體后，用 55％ 硫酸銨鹽析后壓濾，再將酶泥溶于 ，用通用兩性一號離子交換樹脂進行脫色 (收率 93％ )，用真空薄膜刮板蒸發(fā)器于 40℃濃縮至 2倍以上 (收率 90％ )，再用 732 陽離子、 701 陽離子樹脂混合床脫鹽 (收率 90％ )，最后進行噴霧干燥或冷凍干燥、磨粉即成。成品為淡黃至乳白色粉末，酶活性為 40 萬～ 60 萬 U/g。 ②單寧酸沉淀法；在攪拌下向發(fā)酵濾液 (pH 左右 )加入 10％單寧酸，使單寧酸的終濃度 1％左右，靜置 1h，離心收集酶與單寧酸的復(fù)合物。再向此復(fù)合物中加入 10％聚乙二 醇 (分子量 6 000)，使聚乙二醇用量相當原酶液的 ％～ ％，不斷攪拌，離心去除單寧聚乙二醇聚合物，經(jīng)此過程，酶液可以濃縮 10 倍，總收率 90％以上。向濃縮酶液加入糖用活性炭3％ (在 pH 左右 )脫色，得到淺黃脫色酶液，酶回收率 90％～ 95％，脫色酶液或用酒精在低溫下沉淀，或用硫酸銨鹽析制成淺色酶粉，其活性可達 40 萬～ 60 萬 U/g，總收率 70％以上。 二、中性微生物蛋白酶 （一）中性蛋白酶的性質(zhì) 大多數(shù)中性微生物蛋白酶是含鋅離子的金屬酶，相對分子量質(zhì)量 35000～ 40 000，等 電點為 8～ 9，是微生物蛋白酶中最不穩(wěn)定的酶，很易自溶，即使在低溫冰凍干燥，也會造成分子量的明顯減少。性質(zhì)見表 58。 (二）生產(chǎn)菌種 中性蛋白酶是最早用于工業(yè)生產(chǎn)的蛋白酶。生產(chǎn)菌種見表 59。不少微生物的中性蛋白酶已經(jīng)純化，并進行了詳細研究。商品中性蛋白酶的生產(chǎn)菌種主要是枯草桿菌、耐熱解蛋白芽孢桿菌、寄生曲霉、米曲霉、棲土曲霉、灰色鏈霉菌等。 (三）中性蛋白酶的生產(chǎn)實例 我國生產(chǎn)中性蛋白酶的菌種主要是枯草桿菌 AS11 、 172，棲土曲霉 等。 下面以枯草桿菌 AS 液體深層培養(yǎng)法為例 介紹中性蛋白酶的生產(chǎn)技術(shù)。 1．生產(chǎn)工藝 (圖 58) 2 操作要點 (1)菌種選育。菌種選育如圖 59 所示。制好培養(yǎng)基接種后， 30℃下培養(yǎng) 26h， 0～ 5℃冰箱保存。 AS 的變異株 AS ，產(chǎn)酶能力比母株提高 19％，且較穩(wěn)定。 (2)種子罐培養(yǎng)。種子罐內(nèi)徑 ф 400mm，高 850mm，容積 150L，裝料 70 L，攪拌速度 320 r/mn。培養(yǎng)基在 9 800Pa 滅菌 30min。培養(yǎng)溫度 29～ 31℃ (低溫季節(jié) 30～ 32℃ )，通風量保持在 1: VVm，自然 pH。培養(yǎng) 10 h 后鏡檢菌形，凡菌體瘦細，短而均勻者為優(yōu)，酶活在 400～600 U/mL 較為合適。 (3) 發(fā)酵罐發(fā)酵。發(fā)酵耀內(nèi)徑 ф 200mm，高 2800mm，攪拌轉(zhuǎn)速 220r/min，投料量 1200L。接種量 6％～ 8％，培養(yǎng)溫度按前期升溫法培養(yǎng)，即在第 5～ 8h 內(nèi)，每小時升溫 2℃，9～ 12h，每小時降溫 2℃，第 12h 后保持 30～ 32℃。通風量 0～ 12h 為 1:； 12～ 20h為 1: ： 20h 后為 1: ，攪拌轉(zhuǎn)速 320r／ min。發(fā)酵 26～ 28h，酶活力 6 000～7000U/mL， pH 左右，總糖約為 ％，殘?zhí)菫?％以下。 (4)酶的提煉與產(chǎn)品標準化。向發(fā)酵液加入 CaCl2 ％， ～ ，攪拌 30min，壓濾去雜質(zhì)，清液用薄膜蒸發(fā)器在 35～ 40℃，真空度 179。 l04～ 179。 104Pa 下濃縮至原體積的 1/2以下，再加工業(yè)硫酸銨至濃度 42％，鹽析 12～ 16h，除去上清液后，加硅藻土 2％，經(jīng)離心分離或壓濾，取出酶泥，絞碾成細條，置真空度 179。 104～ 179。 104Pa 35℃干燥之后，磨粉即為成品。成品酶活性為 10 萬 U/g 左右?？偸章始s 55％， 1t 發(fā)酵液可得到酶粉約 16kg。 提煉各工序酶的回收率統(tǒng)計見表 510。原酶粉常需添加填料，以制得酶活均一的酶制劑，填料應(yīng)選用不損害酶的活性、不吸濕，又不影響使用的材料。 CaCO淀粉、乳糖、明膠、硅藻土、 Na2SO NaCl、 MgO、 NaHCO3等均是工業(yè)上常用的填料。 蛋白酶作藥用時，需將粗酶純化，工藝流程見圖 510。操作要點如下：粗酶加水 (1: 10)浸提，再加濃度為 70％的 CaCl2溶液 20％ (體積分數(shù) )及 25％ (NH4)2SO4 (mg/L )作為凈化助 濾劑，過濾后得到澄清酶液，再加 35％ (NH4)2SO4 鹽析酶，過濾收集酶泥溶解于 磷酸鹽緩沖液中，通過葡聚糖凝膠 G25 脫鹽。柱體為 1cm179。 10 cm，柱中凝膠先用，然后在柱頂注酶，通過的酶量為床體積的 20％，流畢用 ，收集無鹽酶液冷凍干燥即可。按此工藝由粗酶到部分純化酶的收率為 50％以上，每克酶的活性提高 22 倍，達到 120 萬 U/g，酶的比活可提高4 倍。粗酶液中的酶蛋白也可在 5℃用丙酮 沉淀后以 70％丙酮反復(fù)洗滌脫鹽，收率 50％左右。將粗酶鹽析分段，酶的比活可增加 15～ 20 倍。 (5)液體酶的制備。將發(fā)酵液過濾后，用刮板薄膜蒸發(fā)器，在 35～ 40℃，真空度約 85000Pa，濃縮 3 倍后，在酶的穩(wěn)定 pH(～ )下，添加 15％ NaCl 和 2％乙醇，置密閉容器內(nèi) (以減少氧化引起的失活 )，低溫下可保存數(shù)月。 三、堿性微生物蛋白酶 （一）堿性蛋白酶的性質(zhì) 多數(shù)微生物堿性蛋白酶在 pH 7～ 11 范圍內(nèi)有活性。在以酪蛋白為底物時的最適 pH 以～ 為多。這種酶除水解肽鍵外 ，還具有水解酯鍵、酰胺鍵和轉(zhuǎn)酯及轉(zhuǎn)肽的能力。 多數(shù)微生物堿性蛋白酶不耐熱，若在 50～ 60℃加熱 10～ 15min，幾乎其中一半酶的活性下降 50％，只有費氏鏈霉菌與立德鏈霉菌等的堿性蛋白酶，經(jīng) 70℃處理 30min，酶活性僅損失 10％～ 15％。 三、堿性微生物蛋白酶 （一）堿性蛋白酶的性質(zhì) 多數(shù)微生物堿性蛋白酶在 pH 7～ 11 范圍內(nèi)有活性。在以酪蛋白為底物時的最適 pH 以～ 為多。這種酶除水解肽鍵外，還具有水解酯鍵、酰胺鍵和轉(zhuǎn)酯及轉(zhuǎn)肽的能力。 多數(shù)微生物 堿性蛋白酶不耐熱，若在 50～ 60℃加熱 10～ 15min，幾乎其中一半酶的活性下降 50％，只有費氏鏈霉菌與立德鏈霉菌等的堿性蛋白酶，經(jīng) 70℃處理 30min，酶活性僅損失 10％～ 15％。 (三 )堿性蛋白酶的生產(chǎn)實例 地衣芽孢桿菌 2709 液體深層培養(yǎng)法生產(chǎn)堿性蛋白酶是國內(nèi)最早 (1971 年 )投產(chǎn)的堿性蛋白酶，也是最大的一類蛋白酶，其產(chǎn)量占商品酶制劑總量的 20％以上。此酶主要用于加酶洗滌劑制造及制革和絲綢脫膠。 工藝流程 (圖 511) 2．操作要點 (1)菌種培養(yǎng)。制培養(yǎng)基，接試管斜面菌 種，于 37℃培養(yǎng) 24h 后儲藏于 5℃冰箱備用。 (2)種子培養(yǎng)。種子培養(yǎng)是將斜面種子接入茄子瓶 (培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件與斜面相同 )培養(yǎng)后制成懸液，接入種子罐培養(yǎng)液中。種子罐 (1000 L)裝 500 L 種子培養(yǎng)基。在 36℃下，通風量1: ，攪拌速度為 250r/min 下培養(yǎng) 18～ 20h。 (3)發(fā)酵。 10000L 發(fā)酵罐裝培養(yǎng)基 5000L 在 36℃下通風 (前期 1: ，后期 1: 0． 2VVm)攪拌 40h 左右酶活為 8 000～ 10000U/mL。 (4)提取。地衣芽飽桿菌菌體細小，發(fā)酵液 黏度大，直接采用的常規(guī)離心或板框過濾的方法進行固液分離是十分困難的，而且也得不到澄清濾液。目前，國內(nèi)一般工廠都采用無機鹽凝聚的方法或直接將發(fā)酵液進行鹽析。前者即向發(fā)酵液中加入一定量的無機鹽，使菌體及雜蛋白聚集成大一些的顆粒，再進行壓濾。此法雖能除去菌體，但過濾速度仍較慢，且色澤較深；后者即直接向發(fā)酵液進行鹽析，得到酶、菌體、雜蛋白混合體系。 為解決上述問題，可采用絮凝法來處理發(fā)酵液，其做法是：向發(fā)酵液中加入堿式氯化鋁，使終濃度為 ％，然后用堿將發(fā)酵液 pH 調(diào)節(jié)到 左右，再加入聚丙烯酰胺，使終濃度 為 80mg/ml， 50r/min 攪拌 7min 后，靜置一段時間，然后在一定真空度下抽濾，向濾液中加入硫酸鈉，使終濃度為 55％，靜止 24h 后，傾去上清液，加硅藻土 2％，壓濾后干燥，磨粉，即為成品酶。 絮凝法的優(yōu)點是過濾速度快，濾液澄清，經(jīng)鹽析后，所得到的酶活有所提高，色澤比無機鹽法的酶粉淺得多。 第三節(jié) 纖維素酶的生產(chǎn) 一、纖維素酶的性質(zhì)和作用機理 (一 )纖維素酶的組分 纖維素酶是能降解纖維素的一種生物催化劑，它是由若干種互相關(guān)聯(lián)的酶組成的相當復(fù)雜的酶系，而非一種簡單的酶。由 于組成的復(fù)雜性，使得提純困難，從而導(dǎo)致人們對其性質(zhì)的研究不很透徹。根據(jù)組成其中各種酶功能的不同，將纖維素酶分為三大類 (表 12) 二、生產(chǎn)菌種 研究較多的是產(chǎn)酶微生物，包括細菌、放線菌、真菌等。細菌類有紅黃纖維弧菌、普通纖維弧菌、瘤胃球菌和熒光極毛桿菌等：放線菌綱有鏈霉菌、玫瑰色放線菌小單胞菌、纖維放線菌及黑紅旋絲放線菌等：真菌類主要有木霉 (綠色木霉、里氏木霉、康氏木霉等 )、青霉、曲霉和根霉等。 篩選和培育高產(chǎn)的菌種是生產(chǎn)纖維素酶的關(guān)鍵。 二、生產(chǎn)菌種 研究較多的是產(chǎn)酶微生物，包括 細菌、放線菌、真菌等。細菌類有紅黃纖維弧菌、普通纖維弧菌、瘤胃球菌和熒光極毛桿菌等：放線菌綱有鏈霉菌、玫瑰色放線菌小單胞菌、纖維放線菌及黑紅旋絲放線菌等：真菌類主要有木霉 (綠色木霉、里氏木霉、康氏木霉等 )、青霉、曲霉和根霉等。 篩選和培育高產(chǎn)的菌種是生產(chǎn)纖維素酶的關(guān)鍵。 (一 )固體發(fā)酵法生產(chǎn)纖維素酶 1．工藝流程 (圖 513) 2．操作要點 (1)試管斜面菌種培養(yǎng) ①試管斜面培養(yǎng)基。 ②接種與培養(yǎng)。 (2)種子擴大培養(yǎng)