細胞凋亡與增殖的原位檢測-資料下載頁
2024-12-08 11:40本頁面
【正文】 掃描電鏡下，細胞表面結構如偽足、微絨毛等消失，細胞膜呈現(xiàn)波浪狀起伏。 （ TUNEL） 細胞凋亡的多步驟機制作用的最終環(huán)節(jié)，是細胞內源性核酸內切酶的激活而導致核染色質 DNA雙鏈的斷裂。大量 DNA斷片暴露出的 3’羥基在末端轉移酶 (TDT)或 DNA多聚酶的作用下，與生物素或地高辛標記的核苷酸結合，最終借助卵白素或抗地高辛抗體結合的熒光素或辣根過氧化物酶，使凋亡細胞被特異性地標記和顯示出來。 凋亡細胞 DNA斷片暴露出 3’羥基 末端轉移酶 (TDT) DNA多聚酶 核苷酸 生物素 地高辛 卵白素 抗地高辛抗體 辣根過氧化物酶 熒光素 ＋ ＋ （ 1）標本收集 ①經(jīng)福爾馬林固定的常規(guī)組織學切片。 ②冰凍切片， 4％多聚甲醛 4℃ 下固定 30min， 80％乙醇后固定 2h以上（或于 80％乙醇內保存于 20oC冰箱待用）。 ③各種臨床細胞學涂片、刮片、脫落細胞學制片或從組織塊制作的細胞懸液制片以及培養(yǎng)細胞的制片等等，用 1％ 4%多聚甲醛， 4℃ 下固定 1530min，然后于 80%乙醇內后固定 2h以上。 （ 2）標本處理 組織學切片在脫蠟和水化后，先用 20ug/ml蛋白酶 K作用 10— 20min后，再進行其他步驟。其余細胞學制片均需水化后，用 PBS洗滌三次，每次 10min．然后進行標記。 （ 3）標記步驟 按試劑盒說明進行 熒光顯微鏡下，凋亡細胞被特異地標記上很強的綠色熒光，同時顯示出其它的凋亡形態(tài)學特征；而未凋亡細胞無綠色熒光，僅顯示出 PI的紅色熒光，且其細胞核形態(tài)完好。 （ 4）結果觀察 HL－ 60細胞 Apoptotic cells (arrowheads) in the mammary gland as detected with the TUNEL assay (red cells express keratin 5。 hematoxylin counterstaining). 活性 Caspase免疫組化檢測 Caspase是一些半胱氨酸蛋白酶，在凋亡程序的啟動和執(zhí)行過程中起非常重要的作用，直接參與凋亡的早期啟動、凋亡信號傳遞及凋亡晚期事件，導致細胞皺縮、膜出泡及 DNA斷裂。 細胞外膜磷脂酰絲氨酸的親和細胞化學檢測 凋亡早期磷脂酰絲氨酸從細胞膜內側轉移到外側，作為免疫檢測識別標記，通過生物素偶聯(lián)的 Annexin V（鈣離子依賴性磷脂結合蛋白），經(jīng)相應的酶聯(lián)顯色系統(tǒng)進行進行親和細胞化學染色，可以 檢測早期凋亡細胞 。
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