細(xì)胞凋亡與增殖的原位檢測-資料下載頁
2024-12-08 11:40本頁面
【正文】 掃描電鏡下，細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)如偽足、微絨毛等消失，細(xì)胞膜呈現(xiàn)波浪狀起伏。 （ TUNEL） 細(xì)胞凋亡的多步驟機(jī)制作用的最終環(huán)節(jié)，是細(xì)胞內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活而導(dǎo)致核染色質(zhì) DNA雙鏈的斷裂。大量 DNA斷片暴露出的 3’羥基在末端轉(zhuǎn)移酶 (TDT)或 DNA多聚酶的作用下，與生物素或地高辛標(biāo)記的核苷酸結(jié)合，最終借助卵白素或抗地高辛抗體結(jié)合的熒光素或辣根過氧化物酶，使凋亡細(xì)胞被特異性地標(biāo)記和顯示出來。 凋亡細(xì)胞 DNA斷片暴露出 3’羥基 末端轉(zhuǎn)移酶 (TDT) DNA多聚酶 核苷酸 生物素 地高辛 卵白素 抗地高辛抗體 辣根過氧化物酶 熒光素 ＋ ＋ （ 1）標(biāo)本收集 ①經(jīng)福爾馬林固定的常規(guī)組織學(xué)切片。 ②冰凍切片， 4％多聚甲醛 4℃ 下固定 30min， 80％乙醇后固定 2h以上（或于 80％乙醇內(nèi)保存于 20oC冰箱待用）。 ③各種臨床細(xì)胞學(xué)涂片、刮片、脫落細(xì)胞學(xué)制片或從組織塊制作的細(xì)胞懸液制片以及培養(yǎng)細(xì)胞的制片等等，用 1％ 4%多聚甲醛， 4℃ 下固定 1530min，然后于 80%乙醇內(nèi)后固定 2h以上。 （ 2）標(biāo)本處理 組織學(xué)切片在脫蠟和水化后，先用 20ug/ml蛋白酶 K作用 10— 20min后，再進(jìn)行其他步驟。其余細(xì)胞學(xué)制片均需水化后，用 PBS洗滌三次，每次 10min．然后進(jìn)行標(biāo)記。 （ 3）標(biāo)記步驟 按試劑盒說明進(jìn)行 熒光顯微鏡下，凋亡細(xì)胞被特異地標(biāo)記上很強(qiáng)的綠色熒光，同時(shí)顯示出其它的凋亡形態(tài)學(xué)特征；而未凋亡細(xì)胞無綠色熒光，僅顯示出 PI的紅色熒光，且其細(xì)胞核形態(tài)完好。 （ 4）結(jié)果觀察 HL－ 60細(xì)胞 Apoptotic cells (arrowheads) in the mammary gland as detected with the TUNEL assay (red cells express keratin 5。 hematoxylin counterstaining). 活性 Caspase免疫組化檢測 Caspase是一些半胱氨酸蛋白酶，在凋亡程序的啟動(dòng)和執(zhí)行過程中起非常重要的作用，直接參與凋亡的早期啟動(dòng)、凋亡信號(hào)傳遞及凋亡晚期事件，導(dǎo)致細(xì)胞皺縮、膜出泡及 DNA斷裂。 細(xì)胞外膜磷脂酰絲氨酸的親和細(xì)胞化學(xué)檢測 凋亡早期磷脂酰絲氨酸從細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè)，作為免疫檢測識(shí)別標(biāo)記，通過生物素偶聯(lián)的 Annexin V（鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白），經(jīng)相應(yīng)的酶聯(lián)顯色系統(tǒng)進(jìn)行進(jìn)行親和細(xì)胞化學(xué)染色，可以 檢測早期凋亡細(xì)胞 。
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