【正文】 Virus,JEV) ? JEV原屬于報(bào)膜病毒科 (Tongaviridae)乙組蟲媒病毒的黃病毒屬 (Flavivrius) ? 1984年另立為黃病毒科 (Flaviridae) ? JEV分三個(gè)清型： JaGAr,Nakayama和Mie(intremediate type) ? JEV粒子呈球形，呈 20而體對稱，有囊膜，毒粒直徑為 45nm50nm(核心 30nm)，是黃病毒科最小的病毒之一 ? JEV在環(huán)境中不穩(wěn)定 ? 10%滅活兔血清和 %乳白蛋白水解物等對病毒有較好的保護(hù)作用 ? JEV大多數(shù)毒株能凝集鵝、鴿及初生雛雞的紅細(xì)胞， pH以 ? 乙腦病毒可在 79日齡的雞胚和多種組織培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)增殖 ? 通常只在倉鼠腎細(xì)胞、豬腎和羊胎腎細(xì)胞上恒定地引起細(xì)胞病變 (CPE) 乙腦病毒的分子生物學(xué)研究進(jìn)展 ? JEV為單股正鏈 RNA病毒，基因組長 11Kb，沉降系數(shù)為 42S，具有感染性 ? 整個(gè)基因組由 5’端非編碼區(qū) (5’noncoding region,5’NCR)，一個(gè)幾乎跨越整個(gè)基因組的單一開放閱讀框 (ORF)和 3’端非偏碼區(qū) (3’NCR)構(gòu)成，無亞基因組結(jié)構(gòu) ? ORF大小為 ，共編碼約 3430個(gè)氨基酸基 ? ORF編碼 1個(gè)多聚蛋白前體 ? C蛋白起調(diào)節(jié)蛋白和保護(hù)基因組免受核酸酶破壞的作用，與病毒的復(fù)制和生物合成密切相關(guān) ? M蛋白參與病毒的感染過程，它能誘生具有輕度中和作用的抗體 ? E蛋白為主要結(jié)構(gòu)蛋白，該蛋白在大多數(shù)黃病毒中是保守的，它是毒粒表面的重要成份，由它形成的表面抗原決定簇具有血凝活性和中活作用，能刺激機(jī)體產(chǎn)生血凝抑制抗體和中和抗體，可保護(hù)機(jī)體免受病毒的攻擊，與病毒的吸附，侵入，致病和誘導(dǎo)縮主的免疫應(yīng)答等作用密切相關(guān) ? NS1為分泌型糖蛋白，其具體功能不清，但認(rèn)為其參與病毒復(fù)制的早期階段 ,NS1還可能參與病毒的組裝和釋放，是主要的抗原成份之一。NS1蛋白不組成毒粒，所以沒有中和活性和血凝抑制活性，但它具有可溶性補(bǔ)體結(jié)合活性，可在不出現(xiàn)中和抗體的情況下誘生保護(hù)力，即不產(chǎn)生抗體依賴性增強(qiáng)作用， NS1的基因和表型具有高度同源性 ? NS2蛋白可能與膜功能相關(guān) ? NS3蛋白在病毒感染細(xì)胞中對病毒 RNA的復(fù)制具有十分重要的功能 ? NS5可能參與病毒 RNA聚合酶的組成 乙腦的防制及乙腦疫苗的研究進(jìn)展 ? 乙腦的治療沒有特效方法，除采取一般措施外，主要是對癥治療。 ? 本病主導(dǎo)性防制措施是滅蚊和免疫接種 ? 人用乙腦疫苗 :鼠腦滅活疫苗，原代地鼠腎滅活疫苗和原代地鼠腎減毒活疫苗 ? 獸用疫苗主要有減毒活疫苗和鼠腦滅活疫苗 ? 新一代的乙腦疫苗：亞單位疫苗，重組活疫苗和核酸疫苗 乙腦酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 乙腦 ELISA抗原的制備 ? 將病毒分別接種于 9日齡雞胚的尿囊腔中 ，37℃ 進(jìn)行培養(yǎng) 48小時(shí)后收集尿囊液 。 ? 離心棄沉淀 。 ? 上清用冷丙酮沉淀 ， 離心后沉淀冷凍抽干 ,加入生理鹽水溶解 ， 上清作為病毒抗原 。 對照抗原用 同樣方法獲得 。 ELISA最佳 反應(yīng)條件 的確定 ? 病毒抗原及對照抗原分別橫行稀釋包被奇數(shù)列和偶數(shù)列包被過夜 。 ? 將血清縱列稀釋 ， 37℃ 反應(yīng) 1h ? 加入 1:8000兔抗豬酶標(biāo)抗體 ， 37℃ 反應(yīng) 1h ? 加入 OPD底物反應(yīng) 15分鐘 ? 加入 2M H2SO4終止反應(yīng) 。 ? 在 490nm波長下測定 OD值 。 以陽性血清 OD差值大幅度減少時(shí)的抗原稀釋度為最佳包被濃度 ， 以陽性血清 OD差值大幅度減少及陰性血清 OD差值很低的血清稀釋倍數(shù)為血清最佳稀釋倍數(shù) 。 ELISA陽性界限的確定 ? 檢測 92份 HI檢測為陰性的血清 ， 陰陽性臨界值以 ?S/P求得 。 ?S=(病毒抗原包被孔測得血清 OD值 對照抗原包被孔測得血清 OD值 )的平均值 ， P=病毒抗原包被孔測得陽性血清 OD值 對照抗原包被孔測得陽性血清 OD值 。 ? 定性： S/P≥ 陽性界限判為陽性 ? 定量： S/P≥ 陽性界限 的血清最高稀釋倍數(shù)作為效價(jià) 。 ELISA方法的檢驗(yàn) ? 特異性試驗(yàn) ? 重復(fù)性試驗(yàn) ? 對比試驗(yàn) ? 敏感性試驗(yàn) ? 阻斷試驗(yàn) ELISA方法 ? 在 確定最佳反應(yīng)條件 時(shí) ， 考慮到了三個(gè)因素 ， 陽性血清稀釋倍數(shù)影響 OD差值的情況 ， 陰性血清稀釋倍數(shù)影響 OD差值的情況 。 ? 以 HI檢測為陰性的 92份血清為參考初步確定了陽性標(biāo)準(zhǔn) 。 用陽性血清來參比 ， 減少操作誤差 。 ? 采用 OD值之差作為病毒蛋白抗原與血清反應(yīng)產(chǎn)生的 OD值，消除對照抗原的影響。為了減少反應(yīng)時(shí)間不同造成的誤差，將病毒抗原和對照抗原包被在同一塊酶標(biāo)板上奇數(shù)及偶數(shù)列。 ? ELISA與 HI、 ELISA與 LAT檢測結(jié)果 3. 結(jié)果與分析 ? 結(jié)果與分析 ? 最佳致敏濃度：抗原 1:32倍稀釋 ， 蛋白含量為 。 ? 最佳致敏時(shí)間： 30min ? 最佳致敏溫度： 37℃ ? 特異性：乙腦乳膠抗原與 ；與乙腦陽性血清凝集；與乙腦陰性血清 、 牛血清 、 豬布氏桿菌 、 豬衣原體 、 豬細(xì)小病毒 、 豬偽狂犬 、 豬繁殖與呼吸綜合征 、 豬萎縮性鼻炎陽性血清不凝集 。 ? 重復(fù)性：批內(nèi)及批間檢測結(jié)果基本一致 。 LAT與 HI的對比試驗(yàn) ? 經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析差異不顯著 (P)。 HI + 合計(jì) 陽性率 % LAT + 56 6 62 5 27 32 合計(jì) 61 33 94 陽性率 % 符合率 % 乳膠凝集抗原保存期試驗(yàn) ? 0℃ 4℃ 可保存一年以上 , 室溫可保存二個(gè)月 ,表明乙腦乳膠抗原便于保存和運(yùn)輸 。 ? 用乳膠凝集試驗(yàn)檢測了 1613份送檢血清 ， 其中陽性份數(shù) 652份 ， 陰性份數(shù) 961份；陽性率為 %。 01020304050604 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3月份陽性率(%)圖 1： 血清乙腦抗體在不同月份的陽性率情況 II