臨床醫(yī)學工程實踐實驗報告-資料下載頁
2025-08-24 08:07本頁面
【導讀】臨床醫(yī)學工程實踐。實驗一制備試劑配方。通過本次實驗，掌握10×TBEBuffer、PBSBuffer、1MTris-HCl、10%（W/V）。SDS、5MNaCl、MEDTA、CTAB/NaCl溶液的配置方法和技術(shù)，為后續(xù)實。儀器名稱規(guī)格型號。京制00000249號電子天平e=10d. 數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋。燒杯50ml、100ml、200ml、500ml. 立式壓力蒸汽滅菌器YXQ-LS-50SII. 試劑組分溶度配置量配制方法。160ml的去離子水，充分攪拌溶解；，置于燒杯中；2、向燒杯中。拌溶解；3、滴加濃鹽酸將pH值調(diào)。節(jié)至，然后加去離子水將溶液。定容至200ml；4、高溫高壓滅菌后，溶液調(diào)節(jié)至pH；4、將溶液定。中，加入約40ml的去離子水，68℃。來配置；在問題及時發(fā)現(xiàn)后，我們重新用Tris配置了10×TBEBuffer。實驗二細胞傳代培養(yǎng)和基因組DNA提取。5)加入10%胎牛血清培養(yǎng)基3ml，用吸管反復吹打瓶壁上的細胞，使細胞脫落到。5)將兩瓶細胞放到細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。3)將兩個培養(yǎng)瓶拿到倒置顯微鏡下觀察并拍照。4)分別在兩瓶中加入%胰蛋白酶，輕輕搖動培養(yǎng)瓶，經(jīng)胰酶液體鋪滿。5)各加入10%胎牛血清培養(yǎng)基
【正文】 Tanon EPS 300 錐形瓶 100ml SL302N 型電子天平 300g/ 00455 實驗試劑 瓊脂糖 10TBE Buffer DNA 樣品 6Loading buffer 溴化乙錠 1TAE Marker 150bp 三、 實驗流程 稀釋： 將 10TBE Buffer 稀釋為 TBE Buffer； 制備 1%瓊脂糖凝膠 (50ml)： 稱取 g 瓊脂糖置于錐形瓶中，加入 50ml TBE。微波爐加熱 ， 至瓊脂糖全部融化，搖勻，即成 %瓊脂糖凝膠液 ； 膠板制備 ： 取制膠槽洗干凈，晾干，放入制膠玻璃板。取透明膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好，形成模子。將內(nèi)槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，直到整個玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取下膠帶，將凝膠及內(nèi)槽放入 電泳槽中。添加 TBE 電泳緩沖液至沒過膠板12mm 為止 ； 加樣 ： 在點樣板上 DNA 樣品 和 PCR 產(chǎn)物分別與 6 loading buffer 混合 ， DNA 樣品（或者 PCR 產(chǎn)物 ） 和 6 loading buffer 的添加比例是 5： 1，將 6 loading buffer稀釋 6 倍； DNA 樣品 5ul+6 loading buffer 1ul PCR 產(chǎn)物 10ul+6 loading buffer 2ul 在點樣板上其中一孔 用 移液槍 加 marker 35ul； 電泳 ： 加樣后的凝膠板通電電泳，電壓 100V，樣品 由負極 (黑色 )向正極 (紅色 )方向移動。當溴酚藍移動到距離膠板 三分之二 處時，停止電泳 ；一般電泳時間為 30— 45min； 染色： 電泳完畢后，取出凝膠，用含有 ug/ml 的溴化乙錠 1 TAE 溶液染色約30 min； 觀察照相 ： 在紫外燈下觀察， DNA 存在則顯示出紅色熒光條帶，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。 注意事項： 在 制備 1%瓊脂糖凝膠微波爐加熱 時，盡量每 30s將裝有瓊脂糖的錐形瓶拿出搖勻，再在微波爐加熱，如此循環(huán)，直至瓊脂糖溶解； 制備 1%瓊脂糖凝膠 前先用記號筆標記溶液頂部水平高度，在完成微波爐加熱后，將 溶液用去離子水定容至標記的位置，因為瓊脂糖溶液在加熱時會存在部分揮發(fā)， 用 10 ul微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個樣品，應更換一個加樣頭，以防污染，加樣時勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。 (注意 :加樣前要先記下加樣的順序 )。 移液槍加樣時應盡量快，防止樣品浮出，無法得出實驗結(jié)果； 凝膠板放置的方向應該是有黑色電極向紅色電極； 跑膠時應注意記下各個孔中所加入的物質(zhì)分別是什么； 常用的緩沖液有 TAE和 TBE，而 TBE比 TAE有著更好的緩沖能力 ； 染色時應注意全程戴上實驗手套，小心操作，因為 溴化乙錠 是有毒性的。 四、 實驗結(jié)果 （紫外燈下的跑膠圖） 跑膠問題： marker： DNA模板、 PCR產(chǎn)物的目的量比 marker最大標量還大，可以更換更大 bp的 marke 跑膠出現(xiàn)了比較嚴重的拖尾現(xiàn)象，可能有這幾點原因：（ 1） DNA模板、 PCR產(chǎn)物純度不夠，受到了污染（ 2） DNA模板濃度過高，會造成可以拖尾而且沒有PCR條帶 解決辦法： （ 1）重新提取細胞 DNA模板及進行 PCR擴增實驗；（ 2）降低 DNA模板添加量或者稀釋 DNA模板再進行添加 右端兩孔有亮點代表孔中存在蛋白質(zhì)，實驗樣品受到蛋白質(zhì)污染 從圖片中 可以看出跑膠的時間有點偏長，超過三分之二的凝膠 間隔的孔中有周邊孔擴散過來的樣品，這點是由于添加樣品的速度太慢 跑膠清晰的條帶太短，因為 有蛋白污染 ， DNA跑不出來，蛋白的正電荷會與負電的 DNA結(jié)合， 使其 在膠孔中跑不出來 五、 實驗心得 這次的跑膠實驗的結(jié)果并沒有得出來，實驗結(jié)果出現(xiàn)了拖尾現(xiàn)象，雖然結(jié)果沒有出來，但是，我也試著學著去分析實驗結(jié)果失敗的原因了，這次實驗結(jié)果失敗可能有以下幾點原因： 模板濃度有誤； 實驗操作時速度太慢導致樣品周圍的孔也受到污染； 模板收到污染，純度不夠。我們?nèi)绻氲玫綄Φ呐苣z圖，可 能需要去更換重新提取 DNA，重做 PCR擴增，得到純凈的樣品。并通過多次操作，提高實驗操作的速度，以防相鄰孔徑受到污染，造成實驗結(jié)果的失誤。跑膠的問題解決可以通過小木蟲網(wǎng)站上去尋求高手的幫助，上面有許多關(guān)于跑膠問題的咨詢，也包括其他一些生物問題。
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