臨床醫(yī)學(xué)工程實(shí)踐實(shí)驗(yàn)報(bào)告-資料下載頁
2025-08-24 08:07本頁面
【導(dǎo)讀】臨床醫(yī)學(xué)工程實(shí)踐。實(shí)驗(yàn)一制備試劑配方。通過本次實(shí)驗(yàn)，掌握10×TBEBuffer、PBSBuffer、1MTris-HCl、10%（W/V）。SDS、5MNaCl、MEDTA、CTAB/NaCl溶液的配置方法和技術(shù)，為后續(xù)實(shí)。儀器名稱規(guī)格型號(hào)。京制00000249號(hào)電子天平e=10d. 數(shù)顯式電熱恒溫水浴鍋。燒杯50ml、100ml、200ml、500ml. 立式壓力蒸汽滅菌器YXQ-LS-50SII. 試劑組分溶度配置量配制方法。160ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?；，置于燒杯中?、向燒杯中。拌溶解；3、滴加濃鹽酸將pH值調(diào)。節(jié)至，然后加去離子水將溶液。定容至200ml；4、高溫高壓滅菌后，溶液調(diào)節(jié)至pH；4、將溶液定。中，加入約40ml的去離子水，68℃。來配置；在問題及時(shí)發(fā)現(xiàn)后，我們重新用Tris配置了10×TBEBuffer。實(shí)驗(yàn)二細(xì)胞傳代培養(yǎng)和基因組DNA提取。5)加入10%胎牛血清培養(yǎng)基3ml，用吸管反復(fù)吹打瓶壁上的細(xì)胞，使細(xì)胞脫落到。5)將兩瓶細(xì)胞放到細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。3)將兩個(gè)培養(yǎng)瓶拿到倒置顯微鏡下觀察并拍照。4)分別在兩瓶中加入%胰蛋白酶，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，經(jīng)胰酶液體鋪滿。5)各加入10%胎牛血清培養(yǎng)基
【正文】 Tanon EPS 300 錐形瓶 100ml SL302N 型電子天平 300g/ 00455 實(shí)驗(yàn)試劑 瓊脂糖 10TBE Buffer DNA 樣品 6Loading buffer 溴化乙錠 1TAE Marker 150bp 三、 實(shí)驗(yàn)流程 稀釋： 將 10TBE Buffer 稀釋為 TBE Buffer； 制備 1%瓊脂糖凝膠 (50ml)： 稱取 g 瓊脂糖置于錐形瓶中，加入 50ml TBE。微波爐加熱 ， 至瓊脂糖全部融化，搖勻，即成 %瓊脂糖凝膠液 ； 膠板制備 ： 取制膠槽洗干凈，晾干，放入制膠玻璃板。取透明膠帶將玻璃板與內(nèi)槽兩端邊緣封好，形成模子。將內(nèi)槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。將冷卻到65℃左右的瓊脂糖凝膠液混勻小心地倒入內(nèi)槽玻璃板上，使膠液緩慢展開，直到整個(gè)玻璃板表面形成均勻膠層。室溫下靜置直至凝膠完全凝固，垂直輕拔梳子，取下膠帶，將凝膠及內(nèi)槽放入 電泳槽中。添加 TBE 電泳緩沖液至沒過膠板12mm 為止 ； 加樣 ： 在點(diǎn)樣板上 DNA 樣品 和 PCR 產(chǎn)物分別與 6 loading buffer 混合 ， DNA 樣品（或者 PCR 產(chǎn)物 ） 和 6 loading buffer 的添加比例是 5： 1，將 6 loading buffer稀釋 6 倍； DNA 樣品 5ul+6 loading buffer 1ul PCR 產(chǎn)物 10ul+6 loading buffer 2ul 在點(diǎn)樣板上其中一孔 用 移液槍 加 marker 35ul； 電泳 ： 加樣后的凝膠板通電電泳，電壓 100V，樣品 由負(fù)極 (黑色 )向正極 (紅色 )方向移動(dòng)。當(dāng)溴酚藍(lán)移動(dòng)到距離膠板 三分之二 處時(shí)，停止電泳 ；一般電泳時(shí)間為 30— 45min； 染色： 電泳完畢后，取出凝膠，用含有 ug/ml 的溴化乙錠 1 TAE 溶液染色約30 min； 觀察照相 ： 在紫外燈下觀察， DNA 存在則顯示出紅色熒光條帶，采用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。 注意事項(xiàng)： 在 制備 1%瓊脂糖凝膠微波爐加熱 時(shí)，盡量每 30s將裝有瓊脂糖的錐形瓶拿出搖勻，再在微波爐加熱，如此循環(huán)，直至瓊脂糖溶解； 制備 1%瓊脂糖凝膠 前先用記號(hào)筆標(biāo)記溶液頂部水平高度，在完成微波爐加熱后，將 溶液用去離子水定容至標(biāo)記的位置，因?yàn)榄傊侨芤涸诩訜釙r(shí)會(huì)存在部分揮發(fā)， 用 10 ul微量移液器分別將樣品加入膠板的樣品小槽內(nèi)，每加完一個(gè)樣品，應(yīng)更換一個(gè)加樣頭，以防污染，加樣時(shí)勿碰壞樣品孔周圍的凝膠面。 (注意 :加樣前要先記下加樣的順序 )。 移液槍加樣時(shí)應(yīng)盡量快，防止樣品浮出，無法得出實(shí)驗(yàn)結(jié)果； 凝膠板放置的方向應(yīng)該是有黑色電極向紅色電極； 跑膠時(shí)應(yīng)注意記下各個(gè)孔中所加入的物質(zhì)分別是什么； 常用的緩沖液有 TAE和 TBE，而 TBE比 TAE有著更好的緩沖能力 ； 染色時(shí)應(yīng)注意全程戴上實(shí)驗(yàn)手套，小心操作，因?yàn)?溴化乙錠 是有毒性的。 四、 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （紫外燈下的跑膠圖） 跑膠問題： marker： DNA模板、 PCR產(chǎn)物的目的量比 marker最大標(biāo)量還大，可以更換更大 bp的 marke 跑膠出現(xiàn)了比較嚴(yán)重的拖尾現(xiàn)象，可能有這幾點(diǎn)原因：（ 1） DNA模板、 PCR產(chǎn)物純度不夠，受到了污染（ 2） DNA模板濃度過高，會(huì)造成可以拖尾而且沒有PCR條帶 解決辦法： （ 1）重新提取細(xì)胞 DNA模板及進(jìn)行 PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)；（ 2）降低 DNA模板添加量或者稀釋 DNA模板再進(jìn)行添加 右端兩孔有亮點(diǎn)代表孔中存在蛋白質(zhì)，實(shí)驗(yàn)樣品受到蛋白質(zhì)污染 從圖片中 可以看出跑膠的時(shí)間有點(diǎn)偏長(zhǎng)，超過三分之二的凝膠 間隔的孔中有周邊孔擴(kuò)散過來的樣品，這點(diǎn)是由于添加樣品的速度太慢 跑膠清晰的條帶太短，因?yàn)?有蛋白污染 ， DNA跑不出來，蛋白的正電荷會(huì)與負(fù)電的 DNA結(jié)合， 使其 在膠孔中跑不出來 五、 實(shí)驗(yàn)心得 這次的跑膠實(shí)驗(yàn)的結(jié)果并沒有得出來，實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)了拖尾現(xiàn)象，雖然結(jié)果沒有出來，但是，我也試著學(xué)著去分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果失敗的原因了，這次實(shí)驗(yàn)結(jié)果失敗可能有以下幾點(diǎn)原因： 模板濃度有誤； 實(shí)驗(yàn)操作時(shí)速度太慢導(dǎo)致樣品周圍的孔也受到污染； 模板收到污染，純度不夠。我們?nèi)绻氲玫綄?duì)的跑膠圖，可 能需要去更換重新提取 DNA，重做 PCR擴(kuò)增，得到純凈的樣品。并通過多次操作，提高實(shí)驗(yàn)操作的速度，以防相鄰孔徑受到污染，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的失誤。跑膠的問題解決可以通過小木蟲網(wǎng)站上去尋求高手的幫助，上面有許多關(guān)于跑膠問題的咨詢，也包括其他一些生物問題。
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