【導(dǎo)讀】患者的表型特征為，所有手和腳的指/趾骨的中間指/趾節(jié)縮短，大拇指的。近端指/趾節(jié)縮短，有時(shí)中間指/趾節(jié)會與遠(yuǎn)端指/趾節(jié)發(fā)生融合。在一些個(gè)體中，掌骨也。在某些家系中，患者的身高會表現(xiàn)得比家系中正常人要矮。常染色體顯性遺傳病[1]。骨發(fā)育異常而導(dǎo)致的一種指（趾）部骨骼畸形的現(xiàn)象。根據(jù)指/趾頭的畸形情況，Bell. A1,A2和A3三個(gè)亞型。Farabee在1903年報(bào)道的短指（趾）被Bell歸為A1型。Haplotype分析表明這兩個(gè)家系是沒有關(guān)聯(lián)的。Haplotype分析后將這個(gè)基因定位到11cM的區(qū)間內(nèi)。在加拿大家系里的患者仍然保留有大大縮短了的中端指節(jié)和遠(yuǎn)端指節(jié)。也很有可能是一種存在遺傳異質(zhì)性的人類疾病。除了PAX3這個(gè)候選基因后，將目標(biāo)轉(zhuǎn)向了IHH。使無毛部分變成有毛，所以被戲稱為―刺猬‖基因。在精細(xì)胞的增殖以及精子發(fā)生的后期發(fā)育當(dāng)中起作用。Dhh被認(rèn)為是與果蠅的Hh基因最為接近的一個(gè)，它被認(rèn)為參與調(diào)節(jié)了四肢骨骼的軟骨發(fā)。棕櫚酸和膽固醇這些疏水結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是將Hedgehog. 胞核內(nèi)激活細(xì)胞靶基因的表達(dá)。

　　

【正文】 moiety at the sn2 position of the glycerol backbone., pathway:Phospholipid metabolism。 CDPdiacylglycerol biosynthesis。 CDPdiacylglycerol from snglycerol 3phosphate: step 2/3., similarity:Belongs to the 1acylsnglycerol3phosphate acyltransferase family., Gli1在 IHH信號通路中信號靶點(diǎn)的體內(nèi)分析 25 圖 49 chIP on chip 部分?jǐn)?shù)據(jù) 圖 410 chIP on chip 分析部分示意圖 Gli1在 IHH信號通路中信號靶點(diǎn)的體內(nèi)分析 26 圖 411 chIP on chip 分析部分示意圖 Gli1在 IHH信號通路中信號靶點(diǎn)的體內(nèi)分析 27 5 分析討論 、逆轉(zhuǎn)錄 PCR 和熒光實(shí)時(shí)定量 PCR 反應(yīng) 反應(yīng) 在反復(fù)優(yōu)化 PCR 的過程中，出現(xiàn)一系列問題，整理如下： （ 1） PCR 擴(kuò)增目的條帶很亮，但前后有拖尾現(xiàn)象； （ 2） 假陰性，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶； （ 3） 假陽性，出現(xiàn)的 PCR 擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致； （ 4） 非特異性擴(kuò)增， PCR 擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶和非特異性擴(kuò)增帶； （ 5） 引物間形成了較多的引物二聚體，使產(chǎn)物很少。 針對上述出現(xiàn)的問題，具體解決方法如下： （ 1） 非特異性擴(kuò)增及條帶模糊問題 可能與 Mg2+濃度、 dNTP 濃度、退火溫度、循環(huán)次數(shù)、 Taq 酶用量、模板 DNA 量以及引物量有關(guān)?？蛇m當(dāng)降低 Mg2+濃度、減少 dNTP 濃度、提高退火溫度（一般退火溫度低時(shí)容易使引物在非特異位置結(jié)合引發(fā)擴(kuò)增反應(yīng)造成拖尾）、 降低循環(huán)次數(shù)、減少 Taq酶用量、降低引物量或適當(dāng)增加模板量。 （ 2） 引物二聚體問題 可能是模板 DNA 濃度過小， Taq 酶、引物或者 Mg2+濃度過高，可適當(dāng)增加模板量，降低 Taq 酶、引物或 Mg2+濃度；可在所配的 MIX 中加入 5%的甘油或 5%的 DMSO，以增強(qiáng)其特異性； PCR 反應(yīng)體系的配制在冰上進(jìn)行，最后加 Taq 酶， PCR 結(jié)束后，產(chǎn)物勿放置在室溫下過長時(shí)間；增加反應(yīng)循環(huán)數(shù)、降低退火溫度，若降低退火溫度后發(fā)現(xiàn)還是只有引物二聚體，則可能是 buffer 等試劑沒有完全溶解、混勻，導(dǎo)致吸 取的試劑濃度不對。 （ 3） 模板 DNA 的質(zhì)量問題 在其他條件不變的情況下，更換其它樣本 DNA 重復(fù)操作，如自殺樣本、精神分裂癥樣本等，觀察擴(kuò)增結(jié)果。實(shí)際證明模板 DNA 沒有降解，但應(yīng)避免反復(fù)凍融，在室溫下放置時(shí)間不能太長。 （ 4） 試劑質(zhì)量問題 在其它實(shí)驗(yàn)條件不變的情況下，分別更換 ddH2O、 buffer、 Taq 酶以及 dNTP，做對比試驗(yàn)，實(shí)際發(fā)現(xiàn)，試劑變性往往引起假陰性結(jié)果。 （ 5） 污染問題 可能是樣本相互間交叉污染， PCR 試劑被模板 DNA 污染。也可能是 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物被污染，這是 PCR 反應(yīng)中最主要最常見的污染問題，因?yàn)?PCR 產(chǎn)物拷貝量大（一般為Gli1在 IHH信號通路中信號靶點(diǎn)的體內(nèi)分析 28 1013 拷貝 /ml），遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 PCR 檢測拷貝數(shù)的極限，所以極微量的 PCR 產(chǎn)物污染，就可能造成假陽性。 （ 6） 操作問題 PCR 實(shí)驗(yàn)的環(huán)節(jié)很多，少加、漏加試劑、離心不充分、循環(huán)參數(shù)設(shè)計(jì)錯(cuò)誤等等都能造成結(jié)果的假陰性，應(yīng)能夠嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，保持注意力集中。 逆轉(zhuǎn)錄 PCR（ Reverse Transcription PCR） 逆轉(zhuǎn)錄 PCR，或者稱反轉(zhuǎn)錄 PCR(reverse transcriptionPCR, RTPCR)，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在 RTPCR中 ，一條 RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ) DNA，再以此為模板通過 PCR 進(jìn)行 DNA 擴(kuò)增。 由一條 RNA 單鏈轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ) DNA(cDNA)稱作 ―逆轉(zhuǎn)錄 ‖，由依賴 RNA 的 DNA 聚合酶 （逆轉(zhuǎn)錄酶）來完成。隨后， DNA 的另一條鏈通過脫氧核苷酸引物和依賴 DNA 的DNA 聚合酶完成，隨每個(gè)循環(huán)倍增，即通常的 PCR。原先的 RNA 模板被 RNA 酶 H 降解，留下互補(bǔ) DNA。 逆轉(zhuǎn)錄的成功與否或者能否得到質(zhì)量較高的 cDNA 直接關(guān)系到接下來的實(shí)驗(yàn)。在進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄的時(shí)候應(yīng)該特別小心。 (1) 在實(shí)驗(yàn)過程中要防止 RNA 的降解，保持 RNA 的完整性。在總 RNA 的提取過程中，注意避免 mRNA 的斷裂。 (2) 為了防止非特異性擴(kuò)增，必須設(shè)陰性對照。 (3) 內(nèi)參的設(shè)定：主要為了用于靶 RNA 的定量。常用的內(nèi)參有 G3PD（甘油醛 3磷酸脫氫酶）、 βActin（ β肌動蛋白）等。其目的在于避免 RNA 定量誤差、加樣誤差以及各 PCR 反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。 (4) PCR 不能進(jìn)入平臺期，出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長度、序列、二級結(jié)構(gòu)以及目標(biāo) DNA 起始的數(shù)量有關(guān)。故對于每一個(gè)目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù)，均應(yīng)通過單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來確定。 (5) 防止 DNA 的污染： (a) 采用 DNA 酶處理 RNA 樣品。 (b) 在可能的情況下，將 PCR 引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和 mRNA的共線性。 熒光實(shí)時(shí)定量 PCR 反應(yīng) 本實(shí)驗(yàn)采用的是半定量 RT –PCR，半定量實(shí)驗(yàn)的結(jié)果直接影響著接下來的實(shí)驗(yàn)。半定量 RTPCR 是目前研究基因轉(zhuǎn)錄水平的有效手段 , 可用來檢測基因表達(dá)及其變化狀況 , 并可進(jìn)行定量分析。同時(shí)半定量 RT —PCR 方法在病原體檢測、轉(zhuǎn)基因的安全檢測及腫瘤的研究方面也有非常廣泛的應(yīng)用。 半定量 RT PCR 技術(shù)的關(guān)鍵因素 Gli1在 IHH信號通路中信號靶點(diǎn)的體內(nèi)分析 29 (1) 總 RNA 和 cDNA 的質(zhì)量 只有在總 RNA 未被降解的情況下 , 才能保證其中 mRNA 的完整性和隨后反轉(zhuǎn)錄的 cDNA 的質(zhì)量 ,從而真實(shí)反映基因的表達(dá) . (2) 引物的選擇 PCR 反應(yīng)的特異性是由一對上下游引物所決定的 , 因此引物的好壞往往是 PCR 反應(yīng)成敗的關(guān)鍵。引物包括擴(kuò)增目的基因的引物及擴(kuò)增 內(nèi)參基因的引物 , 引物的設(shè)計(jì) , 要根據(jù)基因的非保守序列設(shè)計(jì) , 以保證擴(kuò)增的特異性 . (3) PCR 循環(huán)數(shù)的確定 選擇合適的循環(huán)數(shù)不僅能使擴(kuò)增產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上清晰可見和定量，也可使擴(kuò)增反應(yīng)在到達(dá)平臺期前的線性范圍內(nèi)進(jìn)行。在 RTPCR 方法中 , 反應(yīng)的循環(huán)數(shù)是一個(gè)必須分析的參數(shù)。 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的量與循環(huán)數(shù)之間有一線性關(guān)系。前期的擴(kuò)增產(chǎn)物量隨循環(huán)數(shù)的遞增而成比例增加。隨著 DNA 聚合酶活性的下降和溶液中反應(yīng)底物的消耗 , 擴(kuò)增產(chǎn)物將達(dá)到一個(gè)平臺。半定量分析的循環(huán)數(shù)應(yīng)確定在成比例的線性關(guān)系范圍內(nèi)。表達(dá)豐度不同的基因半定量分析的 PCR 循環(huán)數(shù)不同。 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)是酶促反應(yīng)，遵循酶促反應(yīng)定律 , 開始的循環(huán)內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)物呈指數(shù)累積，產(chǎn)物與模板呈線性關(guān)系，半定量 RTPCR 技術(shù)正是利用產(chǎn)物與模板的這一線性關(guān)系 , 通過擴(kuò)增產(chǎn)物來對比總 RNA 中目的基因的表達(dá) , 但經(jīng)過一定的循環(huán)后 , PCR 產(chǎn)物不再呈指數(shù)累積而進(jìn)入平臺期 , 在平臺期低水平表達(dá)的目的 RNA 可能會增加到與高水平表達(dá)的目的 RNA 相同的濃度，因此，為避免平臺效應(yīng)的影響 , 合 適的循環(huán)數(shù)是 PCR 半定量方法的關(guān)鍵因素之一。 (4) 合適內(nèi)參的選擇 設(shè)立內(nèi)參照可以減少因 RNA 定量時(shí)產(chǎn)生的誤差 , 也可消除細(xì)胞個(gè)數(shù)的差別所帶來的誤差 . 為避免 RNA 抽提、加樣、測量、 cDNA 合成及 PCR 反應(yīng)過程中的某些系統(tǒng)誤差和人為誤差 , 實(shí)驗(yàn)要選用在生物體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)且在其它生理?xiàng)l件下不受影響或影響很小的持家基因片段作為內(nèi)參 .傳統(tǒng)的半定量 RTPCR 技術(shù)多以 βact in 作內(nèi)參 , 另外常用的內(nèi)參照還有 GAPDH, 它是一種細(xì)胞內(nèi)代謝酶 , 其基因?qū)儆诒Ｊ匦詮?qiáng)的“管家基因” , 該基因在生物體內(nèi)普遍存在 且穩(wěn)定表達(dá)。 βMG 也是常用的內(nèi)參 , 研究表明 18 S rRNA 具有更強(qiáng)的保守性和更普遍而恒定表達(dá)的特性 , 因此在很多情況下也常常被用作內(nèi)參 . 不同的生物體其生命過程和生理過程各不相同 , 選用何種內(nèi)參要根據(jù)目的基因和實(shí)驗(yàn)的具體情況而定。 染色質(zhì)免疫沉淀的鑒定 當(dāng)目的蛋白的 DNA 靶序列是未知的，或者要研究目的蛋白與基因組上 DNA 結(jié)合的分布情況時(shí)，用染色質(zhì)免疫沉淀分析得到的結(jié)果有很大一部分是假陽性，需要采用其他方法驗(yàn)證結(jié)果的真實(shí)性。 Gli1在 IHH信號通路中信號靶點(diǎn)的體內(nèi)分析 30 (a) 用 PCR 方法進(jìn)行獨(dú)立的 ChIP 分析 針對染色質(zhì)免疫沉淀篩選出的目的蛋白潛在的 DNA 靶序列設(shè)計(jì)特異的引物，采用定量或半定量 PCR 的方法，進(jìn)行獨(dú)立的 ChIP 實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證二者確實(shí)能結(jié)合。另外，還可以用 RNA Polymerase II 的抗體做 ChIP 實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證篩選的靶序列是否含有某個(gè)基因的啟動子。 (b) 熒光素酶報(bào)告系統(tǒng) (c) 電泳遷移率變動分析 (d) 酵母單雜交系統(tǒng) (e) 一系列序列缺失和突變實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)采用 RTPCR 來鑒定 鑒定 我們從上述的實(shí)時(shí)定量 PCR 的方法檢測到一些 Gli1 的相關(guān)基因，通過染色質(zhì)免疫沉淀的方法來鑒定這些基因是否是與 Gli1 直接調(diào)控的靶基因。由上述實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果可以知道除了 Gli1 本身之外 Ptc1 可能是其直接的靶基因。我們再次選擇 Ptc1 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR 進(jìn)行檢測。如圖 53 可以看出，在正常蛋白中 Ptc1 的富集程度比較高，這與之前的結(jié)果相符。 全基因組擴(kuò)增 全基因組擴(kuò)增 (whole~mome amplification， WGA)是一組對全部基因組序列進(jìn)行非選擇性擴(kuò)增的技術(shù)，其目的是在沒有序列傾向性的前提下大幅度增加 DNA 的總量。全基因組擴(kuò)增的主要目的是在如實(shí)反映基因組原貌的基礎(chǔ)上最大限度地增加 DNA 量 。因此，擴(kuò)增效率和保真性是衡量全基因組擴(kuò)增技術(shù)優(yōu)劣的主要標(biāo)準(zhǔn)，此外，擴(kuò)增片段的大小對于序列較長的基因片段分析來講也是一個(gè)重要因。 1. 擴(kuò)增效率 不同的摸板擴(kuò)增效率差別很大，一般說來，新鮮完整的細(xì)胞，如體外培養(yǎng)的細(xì)胞、外周血淋巴細(xì)胞等擴(kuò)增效率最高，而組織切片，特別是經(jīng)甲醛溶液固定的石蠟切片 DNA擴(kuò)增效率最低，可能是由于在切割制片及后續(xù)處理中 DNA 受損質(zhì)量下降所致。但即便如此，其擴(kuò)增效率仍然非?？捎^。 2. 序列保真性 WGA 要求擴(kuò)增 DNA 能如實(shí)反映模板原貌，這包括兩方面：一是全部或絕大部分基因組序列能被以相同的比例擴(kuò)增 ，即覆蓋率問題；二是盡量城少原摸扳中不存在的序列。 本實(shí)驗(yàn)中為提高所得 DNA 濃度，進(jìn)行 2 次 WGA 全基因組擴(kuò)增。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論 Gli1在 IHH信號通路中信號靶點(diǎn)的體內(nèi)分析 31 染色質(zhì)免疫沉淀能夠有效地富集 Gli1 的直接靶序列，有利于接下來的芯片實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)可以捕捉到在染色質(zhì)水平上基因表達(dá)調(diào)控的瞬時(shí)事件，從而反映體內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的真實(shí)情況。隨著功能基因組學(xué)研究的深入開展，在染色質(zhì)水平研究基因的表達(dá)調(diào)控是全面闡明真核基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的有效途徑。 ChIP 不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與 DNA 的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)的關(guān)系。而且， ChIP 與其他方法的結(jié)合，擴(kuò)大了其應(yīng)用范圍。 ChIP 與基因芯片相結(jié)合所建立的 ChIPonchip 方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選； ChIP 與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)； RNA_ChIP 用于研究 RNA 在基因表達(dá)調(diào)控中的作用。由此可見，隨著 ChIP 的進(jìn)一步完善，它必將會在基因表達(dá)調(diào)控研究中發(fā)揮越來越重要的作用。 本實(shí)驗(yàn)首次確定了 Gli1 在 Hedgehog 信號通路基因組中的結(jié)合位點(diǎn)， 從而可以預(yù)測許多尚未 報(bào)道的 Ihh 的直接作用位點(diǎn)。 同時(shí) 能夠更加清楚的了解 Ihh 的靶位點(diǎn)以及骨骼發(fā)育過程中相關(guān)基因的作用，同時(shí)為現(xiàn)有的骨骼發(fā)育模式提供新的見解并完善。 Gli1在 IHH信號通路中信號靶點(diǎn)的體內(nèi)分析