rt-pcr實驗心得-資料下載頁
2025-08-12 05:32本頁面
【導(dǎo)讀】,用PBS洗細(xì)胞兩次，棄盡PBS后加2mlTRIzol（量大無防！）,細(xì)胞用用吹打管吹至液體澄清且無。10下，室溫5分鐘.2個EP管中各加入ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15秒并。將其在30°C下孵育2—3分鐘。12,000×g的離心力高速冷凍離心10分鐘。深,以防洗上中層液體!;離心前注意放管的方向,此時RNA沉淀形成一膠狀片狀。沉淀附著于試管壁和管底。-20°C)1ml來洗滌RNA沉淀→在2—8°C下以不超過7,500×g的離心力高速。7棄上清，置于衛(wèi)生紙上，自然晾干,用20-50μlDEPC水溶解。體體系反應(yīng)物,在分裝于PCR管中(分裝前宜離心!),再分別加RNA和引物/內(nèi)。5要有要有逆轉(zhuǎn)錄和初始熱活化;bcl-2擴(kuò)增條件為94℃4min，94℃。30s、63℃30s、72℃1min,33個循環(huán),72℃7min；bax擴(kuò)增條件為94℃5min,94℃。皮膚經(jīng)常帶有細(xì)菌和霉菌，可能污染RNA的抽提并成。培養(yǎng)良好的微生物實驗操作習(xí)慣預(yù)防微生物污染。導(dǎo)致的RNA酶交叉污染。例如，使用RNA探針的實
【正文】 理與準(zhǔn)備 塑料制品：（包括槍頭、 EP 管、槍頭盒、勻漿管等 !） 先將 DEPC 水從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料制品逐個浸泡其中，其中小槍頭需要吸管打入 DEPC 水，過夜，然后高壓，再烤干備用，實驗前將槍頭等 放入吸頭臺，再高壓一次（ EP 管） 玻璃制品：泡酸過夜，沖洗干凈，蒙錫紙烤干備用（ DEPC 水泡）（洗凈后先泡 1‰DEPC 過夜，再烤干）玻璃器材 180 度干烤 8 小時 . 勻漿器：（包括剪刀、鑷子）先洗凈后，再高壓（不需要泡 DEPC!） 三、試劑配制： DEPC 水：吸出 1ml 放在 1000ml 雙蒸水中配成 1‰DEPC 水，放在 1000ml容量瓶中靜置 4 小時備用。 75%乙醇：用無水乙醇 +DEPC 水配，然后放 20℃ 保存 ,或提前 10 分配好 .（其中 DEPC 水需先高壓 !） 異丙醇：放入棕色瓶中 . 氯仿：放入棕色瓶中 . 注 :氯仿，無水乙醇，異丙醇均需重新開瓶，最好分裝于幾個 EP 管 ! 瓊脂糖 . *PBS 均用用滅菌之 DEPC 水配制。 *Trizol， RTPCR 試劑盒 *無 RNA 酶的水 或 % SDS 溶液 [調(diào)配無 RNA 酶的水，將水加入無 RNA 酶的玻璃瓶中，加入 DEPC 至 % (v/v ：體積比 )。放置過夜并高壓滅菌。 SDS 溶液必須用 DEPC 處理過并經(jīng)高壓滅菌的水配制。 四、幾種緩沖液的配制： 電泳緩沖液： TAE Tris 54g 硼酸 EDTA 20ml 蒸溜水 1000ml 5TBE （貯存液） 再將 5TBE 稀釋 10 倍成 就可以在電泳時使用（即工作液濃度），如取50ml 貯存液 +450ml 水 ——→ 500ml ■ 2020915 的收獲 工作緩沖液 TBE,我的是 10TBE 的濃縮液 , 100ml 的 10TBE 的濃縮液加入 1900 的三蒸水 ,既是為 . 電泳緩沖液是 6緩沖液上樣緩沖液： %溴酚藍(lán) %二甲苯青 FF 30%甘油 6緩沖液， 4℃ 保存 五、瓊脂糖凝膠 的配制： % / %:： +100ml 電泳緩沖液，微波爐中火 30 秒至沸騰，熔化的瓊脂物冷卻至 60℃ 時充分混勻，將溫?zé)岬哪z倒入已置好梳子的膠膜中，在室溫下放置 3045min 后現(xiàn)進(jìn)行電泳。
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