【導(dǎo)讀】謝必不可少的條件。但空氣中含有各種各樣的微生物，這些微生物隨著空氣進(jìn)入培養(yǎng)液，在。破壞預(yù)定發(fā)酵的正常進(jìn)行，使發(fā)酵產(chǎn)率下降，甚至徹底失敗。發(fā)酵工程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)?？諝鈨艋姆椒ê芏啵鞣N方法的除菌效果、設(shè)備條件和經(jīng)。濟(jì)指標(biāo)各不相同。實(shí)際生產(chǎn)中所需的除菌程度根據(jù)發(fā)酵工藝要求而定，、既要避免染茵，又。要盡量簡化除菌流程，以減少設(shè)備投資和正常運(yùn)轉(zhuǎn)的動(dòng)力消耗。本章將討論合理選擇除菌方。法，決定除菌流程以及選用和設(shè)計(jì)滿足生產(chǎn)需要的除菌設(shè)備等。一個(gè)極低的百分?jǐn)?shù)，從而能控制發(fā)酵污染至極小機(jī)會(huì)。境不同而有很大差異。為主，能利用無機(jī)氮，要求的pH值較低，一般細(xì)菌較難繁殖，而酵母的繁殖速度又較快，能抵抗少量的雜菌影響，因此對(duì)無菌空氣的要求不如氨基酸、抗生素發(fā)酵那樣嚴(yán)格。酸與抗生素發(fā)酵因周期長短不同，對(duì)無菌空氣的要求也不同。一般按染菌機(jī)率為10-3。次發(fā)酵周期所用的無菌空氣只允許1~2次染菌。時(shí)間，促使有機(jī)體死亡。

　　

【正文】 2 Mn++（ ppm） pH 2 2 2 2 (2)培養(yǎng)條件 接種量： ~％ 培養(yǎng)溫度： 32~34℃ 培養(yǎng)時(shí)間： 7~8h 通風(fēng)量： 50L 種子罐 1: 攪拌轉(zhuǎn)速 340r／ min； 250L 種子罐 1: 攪拌轉(zhuǎn)速 300r／ min 500L 種子罐 1: 攪拌轉(zhuǎn)速 230r／ min (3)二級(jí)種子的質(zhì)量要求 種齡： 7~8h pH： 左右 OD 值凈增 左右 無菌檢查 () 噬菌體檢查 () 二、啤酒酵母的擴(kuò)大培養(yǎng) 一般可采用三級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)，擴(kuò)大倍數(shù)：第 1 級(jí)到第 2 級(jí)為 810 倍，第 2 級(jí)到第 3 級(jí)為 46 倍。 1，實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)大培養(yǎng) 2，車間擴(kuò)大培養(yǎng) 第三節(jié) 生產(chǎn)發(fā)酵罐的無菌接種 生產(chǎn)規(guī)模發(fā)酵罐的接種，包括兩個(gè)方面：從實(shí)驗(yàn)室搖瓶或孢子懸浮液容器中移種入一個(gè)種子罐；從一 個(gè)種子罐移入另一個(gè)生產(chǎn)發(fā)酵罐中。 （ 1）從實(shí)驗(yàn)室搖瓶或孢子懸浮液容器接種 通常有兩種方式 2，從種子罐接種 第四節(jié) 菌種的保藏與復(fù)壯 一、菌種的保藏 菌種保藏的意義 菌種是從事微生物學(xué)以及生命科學(xué)研究的基本材料，特別是利用微生物進(jìn)行有關(guān)生產(chǎn)如抗生素、氨基酸、釀造等工業(yè)，更離不開菌種。所以菌種保藏是進(jìn)行微生物學(xué)研究和微生物育種工作的重要組成部分。其任務(wù)首先是使菌種不致死亡，同時(shí)還要盡可能設(shè)法把菌 種的優(yōu)良特性保持下來而不致向壞的方面轉(zhuǎn)化。 菌種保藏的原理 菌種保藏主要是根據(jù)菌種的生理生化特點(diǎn)人工創(chuàng)造條件使孢子或菌體的生長代謝活動(dòng)盡量降低，以減少其變異。一般可通過保持培養(yǎng)基營養(yǎng)成分在最低水平缺氧狀態(tài)，干燥和低溫，使菌種處于 “體眠 ”狀態(tài)，抑制其繁殖能力。 一種好的保藏方法首先應(yīng)能長期保持菌種原有的優(yōu)良性狀不變，同時(shí)還需考慮到方法本身的簡便和經(jīng)濟(jì)，以便生產(chǎn)上能推廣使用。 菌種保藏的方法 （ 1） 斜面低溫保藏法 將菌株接種于合適斜面培養(yǎng)基上，待生長好后置于 4 冰箱保藏，每隔一定時(shí)間進(jìn)行移接培養(yǎng)后再將新斜 面繼續(xù)保藏。 這種保藏方法簡單，存活率高，易于推廣，經(jīng)常使用的菌種可采用這種方法。其缺點(diǎn)是菌種仍有一定強(qiáng)度的代謝活動(dòng)條件，保存時(shí)間不長，而且傳代多，因此菌種客易產(chǎn)生變異。 （ 2） 石蠟油封保藏法 將生長好的新鮮斜面在無菌條件下倒入已滅菌的液體石蠟，油層要高出斜面上端 1cm，使之與空氣隔絕，然后垂直放于室溫或冰箱內(nèi)保藏即可。 這種方法也比較簡便，且保藏時(shí)間一般可長達(dá) l 年以上。適于保存部分霉菌、酵母菌、放線菌，但對(duì)細(xì)菌效果較差，對(duì)某些能同化烴類的微生物則不適用。 （ 3） 砂土管保藏法 將孢子懸浮液轉(zhuǎn)移至滅過菌的砂土 管中，于真空干燥器內(nèi)用真空泵抽干，再轉(zhuǎn)至有干燥劑的容器中，密封低溫保藏。本方法是用人工方法模擬自然環(huán)境使菌種得以棲息。適用于細(xì)菌的芽孢、霉菌和放線菌孢子的保藏，不適于對(duì)干燥敏感的無芽孢的細(xì)菌和酵母菌。主要包括砂土制備和真空抽干兩步。 （ 4）冷凍干燥法 此法的原理是在低溫下迅速將細(xì)胞凍結(jié)以保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整，然后在真空下使水分升華。這樣菌種的生長和代謝活動(dòng)處于極低水平，不易發(fā)生變異和死亡，因而能長期保存，一般為 5~10 年。 微生物在此條件下易死亡，所以需加入一些物質(zhì)作保護(hù)劑，一般常用的是脫脂牛奶、血清等。該法存 活率高，變異率低，并能廣泛適用于細(xì)菌 （ 有芽孢和無芽孢的 ） 、酵母、霉菌孢子、放線菌孢子和病毒等，因此是目前廣泛采用的好方法。其缺點(diǎn)是手續(xù)麻煩，操作復(fù)雜，要求嚴(yán)格，并需有一定設(shè)備條件。 ?（ 5）超低溫保藏法 由于現(xiàn)在超低溫冰箱的使用已較普及，所以菌種的 超低溫保藏法在生產(chǎn)企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)已得到廣泛應(yīng)用。該方法的要點(diǎn)是：將要保藏的菌種置于 10%甘油或二甲基亞砜保護(hù)劑中，密封于試管或安瓿管中，然后將其放入超低溫冰箱中于70℃ 下保藏。該法簡便易行，而且保藏效果較好。 二、發(fā)酵工業(yè)微生物菌種的衰退與復(fù)壯 微生物具有生命活 動(dòng)能力，其世代時(shí)間一般是很短的，在傳代過程中易發(fā)生變異甚至死亡，因此常常造成工業(yè)生產(chǎn)菌種的退化，并有可能使優(yōu)良菌種丟失，所以，如何保持菌種優(yōu)良性狀的穩(wěn)定是研究菌種保藏的重要課題。 （一）微生物菌種的衰退 菌種退化通常是指在較長時(shí)期傳代保藏后，菌株的一個(gè)或多個(gè)生理性狀和形態(tài)特征逐漸減退或消失的現(xiàn)象。常見的菌種衰退在形態(tài)上表現(xiàn)為分生孢子的減少或菌落顏色的改變。在生理上常指菌種發(fā)酵能力的降低，有些菌的抗噬菌體能力下降。對(duì)誘變育種而獲得的高產(chǎn)變異株則常表現(xiàn)出恢復(fù)野生型性狀等。但菌種的真正退化必須與由于環(huán)境原因變化而 引起菌種形態(tài)、和生理上的變異區(qū)別開來。如培養(yǎng)基中微量元素缺乏會(huì)導(dǎo)致孢子數(shù)量減少，也會(huì)引起孢子顏色的改變。此外，溫度、 pH、不同碳氮源都會(huì)導(dǎo)致菌種變化。但只要一旦恢復(fù)正常條件，這些現(xiàn)象就會(huì)消失。此外，雜菌污染也會(huì)造成菌種退化的假象。因此，必須正確判斷是否退化，才能找出正確的解決辦法。一般菌種退化是從量變到質(zhì)變逐漸發(fā)生的，同時(shí)也是整個(gè)群體中產(chǎn)量降低及其相聯(lián)系的種種特性的變化，而不是指單個(gè)細(xì)胞的改變。 引起菌種退化的原因主要有： 基因突變 菌種退化的主要原因是有關(guān)基因的負(fù)突變。如果控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負(fù)突變則 會(huì)引起產(chǎn)量下降，如果控制孢子生成的基因發(fā)生負(fù)突變則孢子性能就會(huì)下降。當(dāng)然，這些負(fù)突變都是自發(fā)形成的。經(jīng)常處于旺盛生長狀態(tài)的細(xì)胞比休眼狀態(tài)細(xì)胞發(fā)生突變的機(jī)率大得多。在發(fā)酵生產(chǎn)中常用營養(yǎng)缺陷型突變株，如缺陷型發(fā)生回復(fù)突變就會(huì)使產(chǎn)量水平下降。如粘質(zhì)賽氏桿菌 (Serratia marcescens)H2892菌株生產(chǎn)力為 18g/L組氨酸，經(jīng) 5次傳代后因回復(fù)突變型增多，產(chǎn)量下降至 4g/L。很多抗生素生物合成、產(chǎn)生氣生菌絲和色素等性狀都部分或全部受質(zhì)?；蚩刂?。當(dāng)菌株連續(xù)傳代、菌體發(fā)生質(zhì)粒脫落而出現(xiàn)大量光禿型菌落，則 生產(chǎn)能力也顯著下降。 變異菌株性狀分離 變異菌株性狀分離也會(huì)引起高產(chǎn)型狀的喪失。在菌種篩選工作中經(jīng)常遇到初篩搖瓶產(chǎn)量很高，復(fù)篩產(chǎn)量逐漸下降而被淘汰的現(xiàn)象，在霉菌中更為常見。這是一種廣義的退化現(xiàn)象。當(dāng)誘變的單菌落是由一個(gè)以上孢子或細(xì)胞形成，而其中只有一個(gè)孢子或細(xì)胞是高產(chǎn)時(shí)，在移接傳代過程中，這個(gè)高產(chǎn)菌株數(shù)量減少，當(dāng)然產(chǎn)量也就下降。即使菌落是由一個(gè)孢子或單個(gè)細(xì)胞形成，只要它是多核細(xì)胞，在誘發(fā)突變中核的變化不會(huì)都一樣，隨著菌種傳代和核的分離也會(huì)使性狀表現(xiàn)多樣化，產(chǎn)量也會(huì)隨之變化，即使是單核孢子發(fā)生突變時(shí)，如果 雙鏈 DNA 上僅一條鏈上某個(gè)位點(diǎn)發(fā)生變化，經(jīng)移殖后也會(huì)出現(xiàn)性狀分離。因此一個(gè)較穩(wěn)定的變異株的獲得必須經(jīng)過多次分離純化。為了得到較多純種，有人考慮提高誘變劑量，使單核細(xì)胞 DNA 雙鏈中一條鏈的某一點(diǎn)發(fā)生突變，另一條鏈完全失活不再復(fù)制來提高純菌產(chǎn)生率。通過實(shí)驗(yàn)得到下表所示數(shù)據(jù)。 不同劑量紫外線處理裂殖酵母時(shí)不純菌落百分?jǐn)?shù) 劑量 （以存活率計(jì)， %） 菌落總數(shù) 突變菌落數(shù) 突變頻率 （突變菌落/103） 不純菌落（ %） 純 不純 100（對(duì)照） 80~100 60~80 20~60 1~20 12165 12060 8553 4922 9884 1 13 46 65 195 — 12 20 17 28 2 27 — 43 30 21 13 誘變突變株的穩(wěn)定性和誘變劑作用機(jī)制有關(guān)，一般認(rèn)為誘發(fā) DNA 堿基轉(zhuǎn)換或顛換時(shí)不穩(wěn)定菌株出現(xiàn)較多，而誘發(fā)缺失交界時(shí)不穩(wěn)定菌株出現(xiàn)較少，因?yàn)槿笔遣荒芑貜?fù)的。 連續(xù)傳代 連續(xù)傳代也是菌種退化的直接原因。個(gè)別細(xì)胞性狀改變不足以引起菌種退化，經(jīng)多次傳代，退化細(xì)胞在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)，于是退化性狀表現(xiàn)逐步明朗化，最終成為一株退化菌株。以芽孢桿菌的黃嘌呤缺陷 型在斜面上移殖代數(shù)對(duì)回復(fù)突變率和產(chǎn)量的關(guān)系為例，如下表所示。 產(chǎn)腺苷的黃嘌呤缺陷型菌株在接種傳代過程中產(chǎn)量和回復(fù)子數(shù)量間的關(guān)系 實(shí)驗(yàn) 移接代數(shù) 每代斜面保存時(shí)間（天） 回復(fù)子比數(shù) 腺苷產(chǎn)量 （ g/L） 1 0 147 1/ 106 2 3 4 5 6 2 6 7 9 12 133， 14 47， 3， 9， 3， 71， 14 47， 3， 9， 3， 13， 58， 14 47， 3， 9， 3， 13， 8， 3， 47， 4 47， 3， 9， 3， 13， 8， 3， 4， 14， 6， 6， 31 1/ 106 1/ 105 1/ 105 1/ 103 1/ 103 由上表可見，雖菌種總的保存時(shí)間都是 147 天，但隨著移植代數(shù)的增加，回復(fù)突變率也增加，腺苷產(chǎn)量下降。這也說明，退化并不突然明顯，而是當(dāng)退化細(xì)胞在繁殖速率上大于正常細(xì)胞時(shí)，每移植一代，使退化細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)更為顯著，從而導(dǎo)致退化。 其它因素 其它如溫度、濕度、培養(yǎng)基成分及各種培養(yǎng)條件都會(huì)引起菌種的基因突變。例在保藏菌種中基因突變率就隨溫度降低而減少，又例在產(chǎn)腺苷的黃膘吟缺陷型 中，若在培養(yǎng)基中加入黃嘌 呤、鳥嘌呤及組氨酸和蘇氨酸可降低回復(fù)突變的數(shù)量。 （二）防止菌種衰退和退化菌種的復(fù)壯 防止菌種衰退 防止菌種衰退的方法有： （ 1）控制傳代次數(shù) 基因的變化往往發(fā)生在復(fù)制和繁殖過程中，繁殖越頗繁，復(fù)制的次數(shù)越多，基因發(fā)生變化的機(jī)會(huì)也就越多。因此應(yīng)該盡量避免不必要的接種和傳代，把傳代次數(shù)控制在最低水平，以降低突變機(jī)率。一般情況下，斜面每移植一代，霉菌、放線菌、芽孢桿菌在低溫下可保藏半年左右，酵母可保藏 3 個(gè)月左右，無芽孢細(xì)菌可保藏 1 個(gè)月左右。為此，生產(chǎn)菌種每移植一代，最好同時(shí)移植較多的斜面，以供一段時(shí)間生產(chǎn)之 需，這樣移植次數(shù)就可減少。 （ 2）選擇合適的培養(yǎng)條件 培養(yǎng)條件對(duì)菌種衰退有一定的影響，選擇一個(gè)適合原種生長的條件可以防止菌種衰退。另外，生產(chǎn)上應(yīng)避免使用陳舊的斜面菌種。 （ 3）利用不同類型的細(xì)胞進(jìn)行傳代 在放線菌和霉菌中，由于它們的菌絲細(xì)胞常含有許多核，甚至是異核體，因此用菌絲接種時(shí)就會(huì)出現(xiàn)衰退和不純的子代。而孢子一般是單核的，利用孢子來接種，可以達(dá)到防止衰退的目的。但是這也必須注意到微生物細(xì)胞本身的特點(diǎn)。對(duì)構(gòu)巢曲霉來說，利用它的分生孢子傳代易發(fā)生衰退而用它的子囊孢子移種則不易退化。 （ 4）選擇合適的保藏方 法 采用有效的菌種保藏方法也可以防止菌種的衰退。 由于菌種衰退的情況不同，對(duì)有些衰退原因還不甚了解，因此要切實(shí)解決具體問題，需根據(jù)實(shí)際情況，通過實(shí)驗(yàn)正確地加以運(yùn)用。 退化菌種的復(fù)壯 使衰退的菌種重新恢復(fù)原來的優(yōu)良特性，稱為 復(fù)壯 。常用的方法是對(duì)已退化菌株用一定培養(yǎng)條件進(jìn)行單細(xì)胞分離純化。從而限制退化菌株在數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)，最后淘汰已退化菌落而使原菌株得得以復(fù)壯。例如用高劑量 UV 或再配以低劑量NTG 對(duì)退化菌株進(jìn)行處理，可得到較多的純菌落，又如選擇一種對(duì)退化型菌株細(xì)胞核具有更大殺傷力的誘變劑亦可使原菌株得到復(fù)壯。 但這工作量不亞于新突變株的誘變育種，另外，用遺傳方法選育不易退化的穩(wěn)定菌株或采用雙缺、三缺菌株及減少傳代次數(shù)等方法，都可防止菌種退化，保存穩(wěn)定菌株。