【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 場(chǎng)中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導(dǎo)致不同蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)方向和運(yùn)動(dòng)速度不同。 （ 2）分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。 （ 3）分離過程：在一定 pH 下，使蛋白質(zhì)基團(tuán)帶上正電或負(fù)電；加入帶負(fù)電荷多的 SDS，形成 “ 蛋白質(zhì)－ SDS 復(fù)合物 ” ，使蛋白質(zhì)遷移速率僅取決于分子大小。 二、實(shí)驗(yàn)步驟 1．樣品處理 ① 紅細(xì)胞的洗滌 洗滌紅細(xì)胞的目的是去除雜蛋白，采集的血樣要及時(shí)采用低速短時(shí)間離心分離紅細(xì)胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細(xì)胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌 10min，低速短時(shí)間離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細(xì)胞已洗滌干凈。 ② 血紅蛋白的釋放 在蒸餾水和甲苯作用下，紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。 注：加入蒸餾水后紅細(xì)胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細(xì)胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。 2．粗分離 ① 分離血紅蛋白溶液 將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為 4 層。第一層為無色透明的甲苯層，第 2 層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第 3 層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第 4 層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明 液體。 ② 透析 取 1mL 的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL 的物質(zhì)的量的濃度為 20mmol/L 的磷酸緩沖液中，透析 12h。透析可以去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液。 3．純化 調(diào)節(jié)緩沖液面：打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝 ↓ 膠面平齊，關(guān)閉出口。 加入蛋白質(zhì)樣品：用吸管將透析后的樣品沿管壁環(huán)繞移動(dòng)加到色譜柱的頂端。加樣后， ∣ 打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內(nèi)，等 樣品完全滲入凝膠層后， ↓ 關(guān)閉出口。 調(diào)節(jié)緩沖液面：加入 20mmol/L 的磷酸緩沖液到適當(dāng)高度 ↓ 洗脫：連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口，進(jìn)行洗脫。 ↓ 收集分裝蛋白質(zhì)：待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時(shí)，用試管收集。 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳（選做） 三、注意事項(xiàng) 1. 電泳技術(shù) 電泳技術(shù)就是在電場(chǎng)的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而 達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行分離、鑒定或提純的目的。 2. 紅細(xì)胞的洗滌 如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)使白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細(xì)胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。 3．如何檢測(cè)凝膠色譜柱的裝填是否成功 由于凝膠是一種半透明的介質(zhì)，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。 此外，還可以加入大分子的有色物質(zhì)，觀察色帶移動(dòng)的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色 譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時(shí)要重新裝柱。 4．為什么凝膠的裝填要緊密、均勻？ 如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會(huì)在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙，使本該進(jìn)入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動(dòng)次序，影響分離的效果。 5．沸水浴處理加入洗脫液的濕凝膠的目的 不但節(jié)約時(shí)間，還能除去凝膠中可能帶有的微生物和排除凝膠內(nèi)的空氣。 6． G75 “G” 代表凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍， 75 表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時(shí)吸水 。 7．裝填完后，立即用洗脫液洗脫的目的：使凝膠裝填緊密 8．加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時(shí)離心？為什么要緩慢攪拌？ 防止血液凝固；防止白細(xì)胞沉淀；防止紅細(xì)胞破裂釋放出血紅蛋白。 9．與其他真核細(xì)胞相比，紅細(xì)胞的特點(diǎn)及這一特點(diǎn)對(duì)進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離的意義 哺乳動(dòng)物及人的成熟的紅細(xì)胞是雙面凹圓餅狀，沒有細(xì)胞核和細(xì)胞器。其含有的血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時(shí)可以通過觀察顏色來判斷什么時(shí)候應(yīng)該收集脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作。 10．如何檢測(cè)血 紅蛋白的分離是否成功 如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關(guān)。 選修 3 一、 基因工程 （ a）基因工程的誕生 （一）基因工程的概念 基因工程是指按照人們的愿望，進(jìn)行嚴(yán)格的設(shè)計(jì)，通過體外DNA 重組和轉(zhuǎn)基因技術(shù)，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品?；蚬こ淌窃?DNA 分子水平上進(jìn)行設(shè)計(jì)和施 工的，又叫做 DNA 重組技術(shù)。 （ a）基因工程的原理及技術(shù) 原理：基因重組 技術(shù)：（一）基因工程的基本工具 1.“ 分子手術(shù)刀 ” —— 限制性核酸內(nèi)切酶（限制酶） （ 1）來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。 （ 2）功能：能夠識(shí)別雙鏈 DNA 分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個(gè)核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性。 （ 3）結(jié)果：經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的 DNA 片段末端通常有兩種形式：黏性末端和平末端。 2.“ 分子縫合針 ” —— DNA 連接酶 (1)兩種 DNA 連接酶（ E?coliDNA連接酶和 T4DNA 連接酶）的比較： ① 相同點(diǎn)：都縫合磷酸二酯鍵。 ② 區(qū)別： E?coliDNA 連接酶來源于 T4 噬菌體，只能將雙鏈 DNA片段互補(bǔ)的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來；而 T4DNA 連接酶能縫合兩種末端，但連接平末端的之間的效率較低。 (2)與 DNA聚合酶作用的異同 :??????????????????????DNA 聚合酶只能將單個(gè)核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯鍵。 DNA 連接酶是連接兩個(gè) DNA 片段的末端，形成磷酸二酯鍵。 3.“ 分子運(yùn)輸車 ” —— 載體 （ 1）載體具備的條件： ① 能在受體細(xì)胞中復(fù)制并穩(wěn)定保存。② 具有一至多個(gè)限制酶切點(diǎn)，供外源 DNA 片段插入。 ③ 具有標(biāo)記基因，供重組 DNA 的鑒定和選擇。 （ 2）最常用的載體是 ??質(zhì)粒 ,它是一種裸露的、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的、獨(dú)立于細(xì)菌染色體之外，并具有自我復(fù)制能力的雙鏈環(huán)狀 DNA 分子。 （ 3）其它載體： 噬菌體的衍生物、動(dòng)植物病毒 (二 )基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的獲取 ： 編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因 。 接分離獲得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反轉(zhuǎn)錄法 _和化學(xué)合成法 _。 技術(shù)擴(kuò)增目的基因 （ 1）原理： DNA 雙鏈復(fù)制 （ 2）過程：第一步：加熱至 90～ 95℃DNA 解鏈；第二步：冷卻到 55～ 60℃ ，引物結(jié)合到互補(bǔ) DNA 鏈；第三步：加熱至 70～ 75℃ ，熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶從引物起始互補(bǔ)鏈的合成。 第二步：基因表達(dá)載體的構(gòu)建 ：使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。 ：目的基因＋啟動(dòng)子＋終止子 ＋標(biāo)記基因 （ 1）啟動(dòng)子：是一段有特殊結(jié)構(gòu)的 DNA 片段，位于基因的首端，是 RNA 聚合酶識(shí)別和結(jié)合的部位，能驅(qū)動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄出 mRNA，最終獲得所需的蛋白質(zhì)。 （ 2）終止子：也是一段有特殊結(jié)構(gòu)的 DNA 片段 ，位于基因的尾端。 （ 3）標(biāo)記基因的作用：是為了鑒定受體細(xì)胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細(xì)胞篩選出來。常用的標(biāo)記基因是抗生素基因。 第三步：將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 _ ：是目的基因進(jìn)入受體細(xì)胞內(nèi)，并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達(dá)的過程。 法： 將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞：采用最多的方法是 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法，其次還有 基因槍法和 花粉管通道法等。 將目的基因?qū)雱?dòng)物細(xì)胞：最常用的方法是 顯微注射技術(shù)。此方法的受體細(xì)胞多是 受精卵。 將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞： ，篩選含有基因表達(dá)載體受體細(xì)胞的依據(jù)是標(biāo)記基因是否表達(dá)。 第四步：目的基因的檢測(cè)和表達(dá) 轉(zhuǎn)基因生物的染色體 DNA 上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA 分子雜交技術(shù)。 目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了 mRNA，方法是采用 用標(biāo)記的目的基因作探針與 mRNA 雜交。 目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì)，方法是從轉(zhuǎn)基因生物中提取 蛋白質(zhì)，用相應(yīng)的 抗體進(jìn)行 抗原－抗體雜交。 個(gè)體生物學(xué)水平的鑒定。如 轉(zhuǎn)基因抗蟲植物是否出現(xiàn)抗蟲性狀。 （三）（ b）基因工程的應(yīng)用 ：抗蟲、抗病、抗逆轉(zhuǎn)基因植物，利用轉(zhuǎn)基因改良植物的品質(zhì)。 ：提高動(dòng)物生長(zhǎng)速度、改善畜產(chǎn)品品質(zhì)、用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)藥物。 ：把正常 的外源基因?qū)氩∪梭w內(nèi)，使該基因表達(dá)產(chǎn)物發(fā)揮作用。 （四）（ a）蛋白質(zhì)工程的概念 蛋白質(zhì)工程是指以蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)規(guī)律及其生物功能的關(guān)系作為基礎(chǔ)，通過基因修飾或基因合成，對(duì)現(xiàn)有蛋白質(zhì)進(jìn)行改造，或制造一種新的蛋白質(zhì)，以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求。（基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì)）（ 1）蛋白質(zhì)工程崛起的緣由：基因工程只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質(zhì) （ 2）蛋白質(zhì)工程的基本原理：它可以根據(jù)人的需求來設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，又稱為第二代的基因工程。 基本途徑：從預(yù)期的蛋白質(zhì)功能出發(fā)，設(shè)計(jì) 預(yù)期的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，推測(cè)應(yīng)有的氨基酸序列，找到相對(duì)應(yīng)的脫氧核苷酸序列（基因）以上是蛋白質(zhì)工程特有的途徑；以下按照基因工程的一般步驟進(jìn)行。（注意：目的基因只能用人工合成的方法） 設(shè)計(jì)中的困難：如何推測(cè)非編碼區(qū)以及內(nèi)含子的脫氧核苷酸序列 二、細(xì)胞工程 （一）植物細(xì)胞工程 （原理）：細(xì)胞全能性 （ b） （ 1）過程：離體的植物器官、組織或細(xì)胞 ―――→ 愈傷組織 ―――→ 試管苗 ――→ 植物體 （ 2）用途：微型繁殖、作物脫毒、制造人工種子、單倍體 育種、細(xì)胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)。 A 植物繁殖 微型繁殖：可以高效快速地實(shí)現(xiàn)種苗的大量繁殖 作物脫毒：采用莖尖組織培養(yǎng)來除去病毒（因?yàn)橹参锓稚鷧^(qū)附近的病毒極少或沒有） 人工種子：以植物組織培養(yǎng)得到的胚狀體、不定芽、頂芽和腋芽等為材料，經(jīng)人工薄膜