【文章內容簡介】 場中受到的作用力大小、方向、阻力不同，導致不同蛋白質在電場中的運動方向和運動速度不同。 （ 2）分離方法：瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳等。 （ 3）分離過程：在一定 pH 下，使蛋白質基團帶上正電或負電；加入帶負電荷多的 SDS，形成 “ 蛋白質－ SDS 復合物 ” ，使蛋白質遷移速率僅取決于分子大小。 二、實驗步驟 1．樣品處理 ① 紅細胞的洗滌 洗滌紅細胞的目的是去除雜蛋白，采集的血樣要及時采用低速短時間離心分離紅細胞，然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細胞液體倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水，緩慢攪拌 10min，低速短時間離心，如此重復洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細胞已洗滌干凈。 ② 血紅蛋白的釋放 在蒸餾水和甲苯作用下，紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。 注：加入蒸餾水后紅細胞液體積與原血液體積要相同。加入甲苯的目的是溶解細胞膜，有利于血紅蛋白的釋放和分離。 2．粗分離 ① 分離血紅蛋白溶液 將攪拌好的混合溶液離心后，試管中的溶液分為 4 層。第一層為無色透明的甲苯層，第 2 層為白色薄層固體，是脂溶性物質的沉淀層，第 3 層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第 4 層是其他雜質的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去之溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明 液體。 ② 透析 取 1mL 的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL 的物質的量的濃度為 20mmol/L 的磷酸緩沖液中，透析 12h。透析可以去除樣品中分子量較小的雜質，或用于更換樣品的緩沖液。 3．純化 調節(jié)緩沖液面：打開色譜柱下端的流出口，使柱內凝膠面上的緩沖液緩慢下降到與凝 ↓ 膠面平齊，關閉出口。 加入蛋白質樣品：用吸管將透析后的樣品沿管壁環(huán)繞移動加到色譜柱的頂端。加樣后， ∣ 打開下端出口，使樣品滲入凝膠床內，等 樣品完全滲入凝膠層后， ↓ 關閉出口。 調節(jié)緩沖液面：加入 20mmol/L 的磷酸緩沖液到適當高度 ↓ 洗脫：連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口，進行洗脫。 ↓ 收集分裝蛋白質：待紅色的蛋白質接近色譜柱底端時，用試管收集。 SDS 聚丙烯酰胺凝膠電泳（選做） 三、注意事項 1. 電泳技術 電泳技術就是在電場的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而 達到對樣品進行分離、鑒定或提純的目的。 2. 紅細胞的洗滌 如果分層不明顯，可能是洗滌次數(shù)少、未能除去血漿蛋白的原因。此外，離心速度過高和時間過長，會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，也得不到純凈的紅細胞，影響后續(xù)血紅蛋白的提取純度。 3．如何檢測凝膠色譜柱的裝填是否成功 由于凝膠是一種半透明的介質，因此可以在凝膠柱旁放一支與凝膠柱垂直的日光燈，檢查凝膠是否裝填得均勻。 此外，還可以加入大分子的有色物質，觀察色帶移動的情況。如果色帶均勻、狹窄、平整，說明凝膠色譜柱的性能良好。如果色 譜柱出現(xiàn)紋路或是氣泡，輕輕敲打柱體以消除氣泡，消除不了時要重新裝柱。 4．為什么凝膠的裝填要緊密、均勻？ 如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會在色譜柱內形成無效的空隙，使本該進入凝膠內部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動次序，影響分離的效果。 5．沸水浴處理加入洗脫液的濕凝膠的目的 不但節(jié)約時間，還能除去凝膠中可能帶有的微生物和排除凝膠內的空氣。 6． G75 “G” 代表凝膠的交聯(lián)程度，膨脹程度及分離范圍， 75 表示凝膠得水值，即每克凝膠膨脹時吸水 。 7．裝填完后，立即用洗脫液洗脫的目的：使凝膠裝填緊密 8．加入檸檬酸鈉有何目的？為什么要低速、短時離心？為什么要緩慢攪拌？ 防止血液凝固；防止白細胞沉淀；防止紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。 9．與其他真核細胞相比，紅細胞的特點及這一特點對進行蛋白質的分離的意義 哺乳動物及人的成熟的紅細胞是雙面凹圓餅狀，沒有細胞核和細胞器。其含有的血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應該收集脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。 10．如何檢測血 紅蛋白的分離是否成功 如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區(qū)帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區(qū)帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關。 選修 3 一、 基因工程 （ a）基因工程的誕生 （一）基因工程的概念 基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格的設計，通過體外DNA 重組和轉基因技術，賦予生物以新的遺傳特性，創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品?；蚬こ淌窃?DNA 分子水平上進行設計和施 工的，又叫做 DNA 重組技術。 （ a）基因工程的原理及技術 原理：基因重組 技術：（一）基因工程的基本工具 1.“ 分子手術刀 ” —— 限制性核酸內切酶（限制酶） （ 1）來源：主要是從原核生物中分離純化出來的。 （ 2）功能：能夠識別雙鏈 DNA 分子的某種特定的核苷酸序列，并且使每一條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵斷開，因此具有專一性。 （ 3）結果：經(jīng)限制酶切割產(chǎn)生的 DNA 片段末端通常有兩種形式：黏性末端和平末端。 2.“ 分子縫合針 ” —— DNA 連接酶 (1)兩種 DNA 連接酶（ E?coliDNA連接酶和 T4DNA 連接酶）的比較： ① 相同點：都縫合磷酸二酯鍵。 ② 區(qū)別： E?coliDNA 連接酶來源于 T4 噬菌體，只能將雙鏈 DNA片段互補的黏性末端之間的磷酸二酯鍵連接起來；而 T4DNA 連接酶能縫合兩種末端，但連接平末端的之間的效率較低。 (2)與 DNA聚合酶作用的異同 :??????????????????????DNA 聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，形成磷酸二酯鍵。 DNA 連接酶是連接兩個 DNA 片段的末端，形成磷酸二酯鍵。 3.“ 分子運輸車 ” —— 載體 （ 1）載體具備的條件： ① 能在受體細胞中復制并穩(wěn)定保存。② 具有一至多個限制酶切點，供外源 DNA 片段插入。 ③ 具有標記基因，供重組 DNA 的鑒定和選擇。 （ 2）最常用的載體是 ??質粒 ,它是一種裸露的、結構簡單的、獨立于細菌染色體之外，并具有自我復制能力的雙鏈環(huán)狀 DNA 分子。 （ 3）其它載體： 噬菌體的衍生物、動植物病毒 (二 )基因工程的基本操作程序 第一步：目的基因的獲取 ： 編碼蛋白質的結構基因 。 接分離獲得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反轉錄法 _和化學合成法 _。 技術擴增目的基因 （ 1）原理： DNA 雙鏈復制 （ 2）過程：第一步：加熱至 90～ 95℃DNA 解鏈；第二步：冷卻到 55～ 60℃ ，引物結合到互補 DNA 鏈；第三步：加熱至 70～ 75℃ ，熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶從引物起始互補鏈的合成。 第二步：基因表達載體的構建 ：使目的基因在受體細胞中穩(wěn)定存在，并且可以遺傳至下一代，使目的基因能夠表達和發(fā)揮作用。 ：目的基因＋啟動子＋終止子 ＋標記基因 （ 1）啟動子：是一段有特殊結構的 DNA 片段，位于基因的首端，是 RNA 聚合酶識別和結合的部位，能驅動基因轉錄出 mRNA，最終獲得所需的蛋白質。 （ 2）終止子：也是一段有特殊結構的 DNA 片段 ，位于基因的尾端。 （ 3）標記基因的作用：是為了鑒定受體細胞中是否含有目的基因，從而將含有目的基因的細胞篩選出來。常用的標記基因是抗生素基因。 第三步：將目的基因導入受體細胞 _ ：是目的基因進入受體細胞內，并且在受體細胞內維持穩(wěn)定和表達的過程。 法： 將目的基因導入植物細胞：采用最多的方法是 農(nóng)桿菌轉化法，其次還有 基因槍法和 花粉管通道法等。 將目的基因導入動物細胞：最常用的方法是 顯微注射技術。此方法的受體細胞多是 受精卵。 將目的基因導入微生物細胞： ，篩選含有基因表達載體受體細胞的依據(jù)是標記基因是否表達。 第四步：目的基因的檢測和表達 轉基因生物的染色體 DNA 上是否插入了目的基因，方法是采用 DNA 分子雜交技術。 目的基因是否轉錄出了 mRNA，方法是采用 用標記的目的基因作探針與 mRNA 雜交。 目的基因是否翻譯成蛋白質，方法是從轉基因生物中提取 蛋白質，用相應的 抗體進行 抗原－抗體雜交。 個體生物學水平的鑒定。如 轉基因抗蟲植物是否出現(xiàn)抗蟲性狀。 （三）（ b）基因工程的應用 ：抗蟲、抗病、抗逆轉基因植物，利用轉基因改良植物的品質。 ：提高動物生長速度、改善畜產(chǎn)品品質、用轉基因動物生產(chǎn)藥物。 ：把正常 的外源基因導入病人體內，使該基因表達產(chǎn)物發(fā)揮作用。 （四）（ a）蛋白質工程的概念 蛋白質工程是指以蛋白質分子的結構規(guī)律及其生物功能的關系作為基礎，通過基因修飾或基因合成，對現(xiàn)有蛋白質進行改造，或制造一種新的蛋白質，以滿足人類的生產(chǎn)和生活的需求。（基因工程在原則上只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質）（ 1）蛋白質工程崛起的緣由：基因工程只能生產(chǎn)自然界已存在的蛋白質 （ 2）蛋白質工程的基本原理：它可以根據(jù)人的需求來設計蛋白質的結構，又稱為第二代的基因工程。 基本途徑：從預期的蛋白質功能出發(fā)，設計 預期的蛋白質結構，推測應有的氨基酸序列，找到相對應的脫氧核苷酸序列（基因）以上是蛋白質工程特有的途徑；以下按照基因工程的一般步驟進行。（注意：目的基因只能用人工合成的方法） 設計中的困難：如何推測非編碼區(qū)以及內含子的脫氧核苷酸序列 二、細胞工程 （一）植物細胞工程 （原理）：細胞全能性 （ b） （ 1）過程：離體的植物器官、組織或細胞 ―――→ 愈傷組織 ―――→ 試管苗 ――→ 植物體 （ 2）用途：微型繁殖、作物脫毒、制造人工種子、單倍體 育種、細胞產(chǎn)物的工廠化生產(chǎn)。 A 植物繁殖 微型繁殖：可以高效快速地實現(xiàn)種苗的大量繁殖 作物脫毒：采用莖尖組織培養(yǎng)來除去病毒（因為植物分生區(qū)附近的病毒極少或沒有） 人工種子：以植物組織培養(yǎng)得到的胚狀體、不定芽、頂芽和腋芽等為材料，經(jīng)人工薄膜