【文章內容簡介】 教授 〔中山大學〕王繼剛 講師 〔華東師范大學〕李鯤鵬 講師 〔中山大學〕課題經(jīng)費比例： 占申請經(jīng)費的31% 課題2，雄性生殖細胞體外誘導分化的基因表達及調控機理研究研究目標：通過對精原干細胞和胚胎干細胞的表觀遺傳，基因表達和外表蛋白差異的系統(tǒng)分析，對視黃素(RA)信號通路及其在精子生成細胞中誘導減數(shù)分裂功能的特異性分析，闡述精原干細胞分化的調控機制，為干細胞體外誘導分化雄性生殖細胞提供依據(jù)。研究內容：1， 利用測序的方法〔如CpG二核苷酸位點上的甲基化〕，cDNA基因芯片的篩選，蛋白質組學和質譜分析技術，系統(tǒng)地比擬胚胎干細胞和精原干細胞DNA甲基化模式、基因表達和細胞外表蛋白成分的差異。2，通過生物信息學技術，利用RAR/RXR在DNA結合區(qū)域的序列保守性，檢索精子前體細胞中RA信號調控的靶基因。分析核受體RAR/RXR復合體在精原細胞中的特異性及其調節(jié)減數(shù)分裂的機理。3．利用全細胞成像及分子生物學技術分析誘導分化的雄性生殖細胞，通過小鼠曲細精管內細胞注射和卵細胞胞漿內精子注射，探索體外誘導分化的生殖細胞的生物學功能及其對小鼠胚胎發(fā)育的影響。課題承當單位：中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院課題負責人： 楊東山 副研究員〔中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院〕主要學術骨干：戚華宇 研究員 〔中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院〕 謝 亭 教授 〔中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院〕 徐仁和 教授 〔中國科學院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院〕課題經(jīng)費比例：占申請經(jīng)費的23%。課題3， 誘導胚胎干細胞向原始生殖細胞分化的體系及機理研究研究目標：本課題將完善胚胎干細胞分化為PGC的技術體系，建立PGC特化過程中關鍵因子的轉基因及基因敲除的胚胎干細胞株及小鼠模型，揭示關鍵轉錄因子及信號網(wǎng)絡在PGC形成過程中的功能及調控機理。研究內容1， 使用我們現(xiàn)有的Oct4GFP及StellaGFP胚胎干細胞株, 結合其它PGC特異性分子標記，利用無血清培養(yǎng)方式, 優(yōu)化促進PGC形成的最正確體外條件；并以gonadal細胞共培養(yǎng)的方式建立適合PGC生長的微環(huán)境。2， 利用轉基因及基因敲除技術，建立特定基因過量表達或缺失的胚胎干細胞株及小鼠模型，探討關鍵基因〔如激素受體及BMP家族〕在小鼠PGC特化過程中的功能及體內轉錄調控模式。 3， 在人胚胎干細胞中創(chuàng)立穩(wěn)定表達標志PGC特化的報告基因體系 (Blimp1GFP和StellaGFP等)，以有效地監(jiān)測PGC的形成，并利用此體系，優(yōu)化從人胚胎干細胞誘導分化PGC的條件，探討關鍵轉錄因子及信號網(wǎng)絡的調控機理。課題承當單位： 華東師范大學課題負責人： 王 媛 特聘教授 〔華東師范大學〕主要學術骨干： 李大力 副研究員 〔華東師范大學〕周文良 教授 〔中山大學〕葉希韻 副教授 〔華東師范大學〕課題經(jīng)費比例： 占申請經(jīng)費的23%。課題4，干細胞向生殖細胞誘導分化技術在農(nóng)業(yè)經(jīng)濟動物培育上的應用研究目標：建立牛ES細胞的體外培養(yǎng)體系和體外定向誘導分化技術平臺，從而揭示牛多能干細胞體外分化與發(fā)育的潛能,獲得具有生物活性的配子〔精子、卵子〕，利用這些技術加速優(yōu)良經(jīng)濟動物種群的培育。研究內容：1，參照人和動物ES細胞建系的技術，選用不同胚齡及各種附植前牛胚胎的內細胞團，建立適宜的牛ES細胞體外培養(yǎng)體系。4， 以其它子課題的蛋白網(wǎng)絡調控等相關研究為根底，利用創(chuàng)立的牛ES細胞體系，探討牛干細胞自我更新和分化的途徑。5， 通過轉基因技術、選擇適宜的生長因子、轉錄因子和培養(yǎng)體系誘導牛ES細胞分化為雄性生殖細胞，為經(jīng)濟動物的改進效勞。6， 以牛ES細胞誘導分化而來的精子為核供體，分析胞質內注射后胚胎的發(fā)育能力，建立以ES細胞體外誘導分化為功能性生殖細胞的技術平臺。課題承當單位： 中國農(nóng)業(yè)大學課題負責人： 朱 捷 教授 〔中國農(nóng)業(yè)大學〕主要學術骨干： 陳瑤生 教授 〔中山大學〕周光斌 副教授 〔中國農(nóng)業(yè)大學〕 于政權 副教授 〔中國農(nóng)業(yè)大學〕課題經(jīng)費比例 占申請經(jīng)費的23%四、年度方案第一年：1, 建立較為理想的從小鼠胚胎干細胞誘導PGC形成的培養(yǎng)體系。2，檢測不同生長因子的誘導作用,并嘗試體外誘導PGC減數(shù)分裂形成功能性配子。3，利用蛋白質組學及BiFC組學研究技術, 系統(tǒng)地從human ORFeome (12000 個基因) 或其他逆轉錄病毒表達庫中篩選直接與Nanog, Oct4，RAR/RXR, Smad相互作用的蛋白。4，別離、純化精原干細胞，利用RAR/RXR在DNA上結合區(qū)域的序列保守性，通過生物信息學，分析、檢索含有與stra8等同源的調控區(qū)的新基因，尋找減數(shù)分裂基因組中在精子前體細胞中表達，受視黃酸誘導調控的基因，為研究減數(shù)分裂調控機制檢索目標基因。5，開展小鼠曲細精管注射及卵母細胞胞漿注射實驗，建立精原干細胞和精子細胞的功能檢測體系，以便于對體外誘導分化所得精原〔精子〕細胞的生物學功能加以驗證。6，建立特定基因過量表達或缺失的轉基因及基因敲除載體。7，在人胚胎干細胞中創(chuàng)立穩(wěn)定表達標志PGC特化的報告基因體系。8，優(yōu)化牛ICM細胞體外維持多能性的細胞因子組合，嘗試獲取牛類胚胎干細胞系和體外培養(yǎng)的技術平臺。預期目標：1， 建立和完善高通量研究蛋白互動網(wǎng)絡的技術平臺，包括蛋白質組學平臺，BiFC組學平臺, 基因組學平臺，生物信息學平臺。2， 別離獲得小鼠精原干細胞；初步完成精子前體細胞中生物信息學分析，確定23個受視黃酸誘導調控并參與減數(shù)分裂調控的目標基因。3， 初步建立胚胎干細胞〔或誘導多能干細胞〕體外培養(yǎng)和誘導分化的培養(yǎng)體系。4， 建立小鼠曲細精管注射及卵母細胞胞漿注射技術體系。5， 成功誘導小鼠胚胎干細胞分化成為PGC，檢測RA、BMP等5種以上信號分子對PGC分化的影響。6， 構建小鼠配子中特異表達的Gpr126等35個重要基因的條件敲除載體或轉基因載體。7， 構建Bli