20xx年醫(yī)學(xué)專題—結(jié)核病細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)化與新技術(shù)進(jìn)展海淀20xx(編輯修改稿)
2024-11-16 04:27 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 sitive ，LFP）：陰性玻片被錯(cuò)誤(cu242。w249。)地判斷為1＋及以下的陽(yáng)性。 低假陰性（Low False Negative， LFN）：1＋及以下玻片被錯(cuò)誤地判斷為陰性。,第三十一頁(yè)，共七十四頁(yè)。,常見(ch225。nɡ ji224。n)“誤差”原因,第三十二頁(yè)，共七十四頁(yè)。,實(shí)驗(yàn)室診斷(zhěndu224。n)的新進(jìn)展,擴(kuò)大開展液體培養(yǎng)(p233。iyǎng)和藥敏試驗(yàn) 引入現(xiàn)代分子生物學(xué)快速檢測(cè)技術(shù) 引入現(xiàn)代免疫學(xué)快速檢測(cè)技術(shù),第三十三頁(yè)，共七十四頁(yè)。,現(xiàn)代分子生物學(xué)檢測(cè)(jiǎn c232。)主要技術(shù),實(shí)時(shí)(sh237。 sh237。)熒光定量PCR 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因檢測(cè) ( Loop mediated isothermal amplification， LAMP) 分子線性探針（Hain 技術(shù)） (2008WHO推薦) 基因芯片技術(shù) GeneXpert MTB/RIF 快速診斷技術(shù),第三十四頁(yè)，共七十四頁(yè)。,（1.1）聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）,PCR誕生于1985年，由美國(guó) Muliis等發(fā)明。PCR是一種根據(jù)脫氧核糖核酸（DNA）復(fù)制原理而設(shè)計(jì)的體外DNA或核糖核酸（RNA）擴(kuò)增方法，由高溫變性、低濕退火及適溫延伸等反應(yīng)組成一個(gè)周期，經(jīng)過n個(gè)周期后，理論上可以獲得2n雙鏈DNA分子(fēnzǐ)，使DNA特定區(qū)段大量擴(kuò)增。此檢測(cè)技術(shù)靈敏度高、特異性強(qiáng)、簡(jiǎn)便、快速，但也存在假陰性、假陽(yáng)性、污染等方面的問題，研究人員對(duì)其進(jìn)行了不懈的研究，使該技術(shù)不斷得到改善，新的PCR及其衍生技術(shù)不斷建立。,第三十五頁(yè)，共七十四頁(yè)。,實(shí)時(shí)熒光(y237。ngguāng)定量PCR,實(shí)時(shí)定量PCR(Real Time Quantitative PCR) 是指在PCR反應(yīng)體系加入熒光基團(tuán)，利用熒光積累能夠監(jiān)控PCR擴(kuò)增的每一個(gè)循環(huán)，在靶ＤＮＡ擴(kuò)增的同時(shí)可獲得定量的結(jié)果.即在同一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)完成擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè),從而省去了靶ＤＮＡ擴(kuò)增后復(fù)雜(f249。z225。)的定量檢測(cè)工作。,第三十六頁(yè)，共七十四頁(yè)。,實(shí)時(shí)熒光(y237。ngguāng)定量PCR,該技術(shù)(j236。sh249。)的優(yōu)勢(shì)在于其擴(kuò)增產(chǎn)物的自動(dòng)和實(shí)時(shí)檢測(cè),減少了常規(guī)ＰＣＲ產(chǎn)物檢測(cè)步驟,也減少了人工判斷結(jié)果的主觀性，提高了結(jié)果的客觀性和可比較性。同時(shí)工作效率大大提高。 研究發(fā)現(xiàn)，該方法的特異性和敏感性較普通ＰＣＲ有所提高。與Southern雜交和酶促化學(xué)發(fā)光技術(shù)檢測(cè)的靈敏度相似,但要比酶促比色法提高10倍。,第三十七頁(yè)，共七十四頁(yè)。,（1.2）環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增基因(jīyīn)檢測(cè) ( Loop mediated isothermal amplification， LAMP),檢測(cè)是連續(xù)等溫進(jìn)行的。 擴(kuò)增效率十分高，反應(yīng)靈敏(l237。nɡ mǐn)。 采用4條引物，識(shí)別6個(gè)位點(diǎn)，特異性強(qiáng)。 不需要特殊的試劑與儀器，總費(fèi)用很低。 反應(yīng)不需要開蓋，在一管內(nèi)完成全部檢測(cè)。 利用Bst酶的鏈置換功能進(jìn)行反應(yīng)。 加入反轉(zhuǎn)錄酶，可以完成ＲＮＡ的一步法檢測(cè)。,第三十八頁(yè)，共七十四頁(yè)。,Purification for Ultra Rapid Extraction (PURE),LAMP 方法(fāngfǎ),PURE 方法(fāngfǎ),等溫反應(yīng) 高擴(kuò)增效率 高特異性 實(shí)驗(yàn)周期短(幾乎(jīhū)一個(gè)小時(shí)),簡(jiǎn)單 去除核酸擴(kuò)增抑制因子 縮短處理時(shí)間,Pretreatment kit,LAMP test,Sample,Lysis,Mixture,Filter,DNA,第三十九頁(yè)，共七十四頁(yè)。,LAMP 檢測(cè)(jiǎn c232。),陰性(yīnx236。ng),陽(yáng)性(y225。ngx236。ng),不需要離心, 等溫, 快速 (整個(gè)過程只需一個(gè)小時(shí))；DNA與SYBR Green結(jié)合現(xiàn)示綠色 ，Bst聚合酶于30分鐘到一個(gè)小時(shí)內(nèi)可將 毫微微克/毫升 (fg/ml)（或500100拷貝/毫升） 的DNA 或RNA擴(kuò)增到10微克左右。,第四十頁(yè)，共七十四頁(yè)。,LAMP 敏感度,10,100,1000,NC,copies/reaction,模板: 純化的 TB 基因組DNA 反應(yīng)(fǎny236。ng)條件: 67℃, 40min,第四十一頁(yè)，共七十四頁(yè)。,LAMP結(jié)果(jiē guǒ)分析,儀器特點(diǎn)： 1.LAMP檢測(cè)專用，每隔6秒測(cè)定反應(yīng)產(chǎn)物的濁度． 2.可以設(shè)定相應(yīng)的反應(yīng)條件與檢測(cè)要求． 3.測(cè)定結(jié)果可直接輸入電腦進(jìn)行實(shí)時(shí)分析(fēnxī)． 4.檢測(cè)結(jié)果（圖像等）可以打?。?5.可同時(shí)檢測(cè)32個(gè)樣本，８聯(lián)管適用．,第四十二頁(yè)，共七十四頁(yè)。,（1.3）、分子(fēnzǐ)線性探針（Hain 技術(shù)）,原理：基于PCR擴(kuò)增的檢測(cè)方法。擴(kuò)增后的產(chǎn)物與預(yù)先固化在膜上的特異性探針雜交，通過顯色反應(yīng)判斷(p224。ndu224。n)結(jié)果，可以鑒定TB和NTM、鑒定TB復(fù)合群、快速檢測(cè)RIF、INH、EMB、喹諾酮類、氨基糖苷類耐藥性,第四十三頁(yè)，共七十四頁(yè)。,GenoType174。 分支(fēnzhī)桿菌試劑盒系列,GenoType 174。 MTBC （來自于培養(yǎng)標(biāo)本的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群菌種間的鑒定(ji224。nd236。ng)） GenoType 174。 Mycobacteria Direct（來自于病人標(biāo)本的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，非結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的鑒定） GenoType 174。 Mycobacterium CM（來自于培養(yǎng)物的結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，非結(jié)核分枝桿菌的鑒定） GenoType 174。 Mycobacterium AS（來自于培養(yǎng)物的其他非結(jié)核分枝桿菌的鑒定） GenoType 174。 MTBDRplus （結(jié)核分枝桿菌利福平、異煙肼耐藥性檢測(cè)） GenoType 174。 MTBDR
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