【文章內容簡介】 sitive ，LFP）：陰性玻片被錯誤(cu242。w249。)地判斷為1＋及以下的陽性。 低假陰性（Low False Negative， LFN）：1＋及以下玻片被錯誤地判斷為陰性。,第三十一頁，共七十四頁。,常見(ch225。nɡ ji224。n)“誤差”原因,第三十二頁，共七十四頁。,實驗室診斷(zhěndu224。n)的新進展,擴大開展液體培養(yǎng)(p233。iyǎng)和藥敏試驗 引入現(xiàn)代分子生物學快速檢測技術 引入現(xiàn)代免疫學快速檢測技術,第三十三頁，共七十四頁。,現(xiàn)代分子生物學檢測(jiǎn c232。)主要技術,實時(sh237。 sh237。)熒光定量PCR 環(huán)介導等溫擴增基因檢測 ( Loop mediated isothermal amplification， LAMP) 分子線性探針（Hain 技術） (2008WHO推薦) 基因芯片技術 GeneXpert MTB/RIF 快速診斷技術,第三十四頁，共七十四頁。,（1.1）聚合酶鏈反應（PCR）,PCR誕生于1985年，由美國 Muliis等發(fā)明。PCR是一種根據(jù)脫氧核糖核酸（DNA）復制原理而設計的體外DNA或核糖核酸（RNA）擴增方法，由高溫變性、低濕退火及適溫延伸等反應組成一個周期，經(jīng)過n個周期后，理論上可以獲得2n雙鏈DNA分子(fēnzǐ)，使DNA特定區(qū)段大量擴增。此檢測技術靈敏度高、特異性強、簡便、快速，但也存在假陰性、假陽性、污染等方面的問題，研究人員對其進行了不懈的研究，使該技術不斷得到改善，新的PCR及其衍生技術不斷建立。,第三十五頁，共七十四頁。,實時熒光(y237。ngguāng)定量PCR,實時定量PCR(Real Time Quantitative PCR) 是指在PCR反應體系加入熒光基團，利用熒光積累能夠監(jiān)控PCR擴增的每一個循環(huán)，在靶ＤＮＡ擴增的同時可獲得定量的結果.即在同一個反應體系內完成擴增和擴增產(chǎn)物的檢測,從而省去了靶ＤＮＡ擴增后復雜(f249。z225。)的定量檢測工作。,第三十六頁，共七十四頁。,實時熒光(y237。ngguāng)定量PCR,該技術(j236。sh249。)的優(yōu)勢在于其擴增產(chǎn)物的自動和實時檢測,減少了常規(guī)ＰＣＲ產(chǎn)物檢測步驟,也減少了人工判斷結果的主觀性，提高了結果的客觀性和可比較性。同時工作效率大大提高。 研究發(fā)現(xiàn)，該方法的特異性和敏感性較普通ＰＣＲ有所提高。與Southern雜交和酶促化學發(fā)光技術檢測的靈敏度相似,但要比酶促比色法提高10倍。,第三十七頁，共七十四頁。,（1.2）環(huán)介導等溫擴增基因(jīyīn)檢測 ( Loop mediated isothermal amplification， LAMP),檢測是連續(xù)等溫進行的。 擴增效率十分高，反應靈敏(l237。nɡ mǐn)。 采用4條引物，識別6個位點，特異性強。 不需要特殊的試劑與儀器，總費用很低。 反應不需要開蓋，在一管內完成全部檢測。 利用Bst酶的鏈置換功能進行反應。 加入反轉錄酶，可以完成ＲＮＡ的一步法檢測。,第三十八頁，共七十四頁。,Purification for Ultra Rapid Extraction (PURE),LAMP 方法(fāngfǎ),PURE 方法(fāngfǎ),等溫反應 高擴增效率 高特異性 實驗周期短(幾乎(jīhū)一個小時),簡單 去除核酸擴增抑制因子 縮短處理時間,Pretreatment kit,LAMP test,Sample,Lysis,Mixture,Filter,DNA,第三十九頁，共七十四頁。,LAMP 檢測(jiǎn c232。),陰性(yīnx236。ng),陽性(y225。ngx236。ng),不需要離心, 等溫, 快速 (整個過程只需一個小時)；DNA與SYBR Green結合現(xiàn)示綠色 ，Bst聚合酶于30分鐘到一個小時內可將 毫微微克/毫升 (fg/ml)（或500100拷貝/毫升） 的DNA 或RNA擴增到10微克左右。,第四十頁，共七十四頁。,LAMP 敏感度,10,100,1000,NC,copies/reaction,模板: 純化的 TB 基因組DNA 反應(fǎny236。ng)條件: 67℃, 40min,第四十一頁，共七十四頁。,LAMP結果(jiē guǒ)分析,儀器特點： 1.LAMP檢測專用，每隔6秒測定反應產(chǎn)物的濁度． 2.可以設定相應的反應條件與檢測要求． 3.測定結果可直接輸入電腦進行實時分析(fēnxī)． 4.檢測結果（圖像等）可以打?。?5.可同時檢測32個樣本，８聯(lián)管適用．,第四十二頁，共七十四頁。,（1.3）、分子(fēnzǐ)線性探針（Hain 技術）,原理：基于PCR擴增的檢測方法。擴增后的產(chǎn)物與預先固化在膜上的特異性探針雜交，通過顯色反應判斷(p224。ndu224。n)結果，可以鑒定TB和NTM、鑒定TB復合群、快速檢測RIF、INH、EMB、喹諾酮類、氨基糖苷類耐藥性,第四十三頁，共七十四頁。,GenoType174。 分支(fēnzhī)桿菌試劑盒系列,GenoType 174。 MTBC （來自于培養(yǎng)標本的結核分枝桿菌復合群菌種間的鑒定(ji224。nd236。ng)） GenoType 174。 Mycobacteria Direct（來自于病人標本的結核分枝桿菌復合群，非結核分枝桿菌復合群的鑒定） GenoType 174。 Mycobacterium CM（來自于培養(yǎng)物的結核分枝桿菌復合群，非結核分枝桿菌的鑒定） GenoType 174。 Mycobacterium AS（來自于培養(yǎng)物的其他非結核分枝桿菌的鑒定） GenoType 174。 MTBDRplus （結核分枝桿菌利福平、異煙肼耐藥性檢測） GenoType 174。 MTBDR