20xx年醫(yī)學專題—第二篇酶及細胞的固定化(編輯修改稿)
2024-11-13 12:19 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 細胞直接固定。 一般只用于單酶或少數(shù)幾種酶催化的反應。 2)吸附法 3)包埋法,2. 固定化方法(fāngfǎ),第三十五頁，共八十六頁。,例如：葡萄糖異構酶(白色鏈霉菌)，是一種胞內(nèi)酶。在5080℃加熱10分鐘，使菌體自溶作用(zu242。y242。ng)的酶失活，而葡萄糖異構酶仍然保持活性，長期使用酶活力不減少。,第三十六頁，共八十六頁。,第三十七頁，共八十六頁。,實驗： 2.4%左右(zuǒy242。u)的卡拉膠 ，70 ℃溶解, 再冷卻到 42℃, +10%左右(zuǒy242。u)的細菌菌體(預熱到42℃） 迅速混合均勻 4 ℃冰箱放置大約30min 取出后切成33mm的小顆粒,第三十八頁，共八十六頁。,一般采用網(wǎng)格包埋法（即凝膠包埋法）。常用凝膠：瓊脂凝膠，海藻(hǎi zǎo)酸鈣凝膠，角叉菜膠和光交聯(lián)樹脂。 注意：一般要加滲透壓穩(wěn)定劑，以防止原生質體破裂。,（三）原生質體的固定化方法(fāngfǎ),第三十九頁，共八十六頁。,第二節(jié) 固定化酶和固定化細胞 的性質與表征 一、固定化酶的性質 影響酶催化活性的因素 1. 構象改變或立體(l236。tǐ)屏蔽以及微擾 2. 分配效應和擴散限制效應,第四十頁，共八十六頁。,第四十一頁，共八十六頁。,第四十二頁，共八十六頁。,（一）酶的活性 ： 通常(tōngch225。ng)低于天然酶（有例外）。 （二）酶的穩(wěn)定性 酶的耐熱性、對變性劑、抑制劑、蛋白酶的抵抗力增加。,第四十三頁，共八十六頁。,可能的原因： ①固定化增加了酶活性構象的牢固程度， 可防止酶分子伸展變形(bi224。n x237。ng)； ②抑制酶的自身降解。 ③固定化部分阻擋了外界不利因素對酶 的侵襲。,第四十四頁，共八十六頁。,如：氨基(ānjī)?；福?70℃，15分鐘，酶失去活性。 而固定化后， 70℃，15分鐘，有80%活性。,第四十五頁，共八十六頁。,（三）酶的最適溫度 最適溫度與酶穩(wěn)定性有關。 多數(shù)酶固定化后熱穩(wěn)定性上升，最適溫度也上升（有例外）。 （四）酶的最適pH 帶負電荷載體 ：最適pH 向堿性偏移(piān y237。)。 帶正電荷載體 ：最適pH 向酸性偏移。,第四十六頁，共八十六頁。,第四十七頁，共八十六頁。,固定化酶的表觀米氏常數(shù)Km隨載體的帶電性能變化。 固定化載體與底物電荷相反,固定化酶的表觀Km值降低。 固定化載體與底物電荷相同(xiānɡ t243。nɡ),固定化酶的表觀Km值顯著增加。,（五）酶的動力學特征(t232。zhēng),第四十八頁，共八十六頁。,與自然酶基本相同。但大分子底物難于接近酶分子，導致(dǎozh236。)酶的專一性發(fā)生改變。,（六）酶的作用(zu242。y242。ng)專一性,第四十九頁，共八十六頁。,與固定化酶相比(xiānɡ bǐ)，固定化細胞的情況比較復雜。 （1）有活性升高的現(xiàn)象。 （2）穩(wěn)定性的增加 。 （3）最適溫度和最適pH常保持不變。,二、固定化細胞(x236。bāo)的性質,第五十頁，共八十六頁。,(一)酶(細胞)的活力 固定化酶通常呈顆粒狀，一般(yībān)用于測定自然酶活力的方法改進后才能用于測定固定化酶。 (二) 蛋白總量 1.雙辛可寧酸法(BCA法) 2.考馬斯亮藍法,三、固定化酶（細胞(x236。bāo)）的評價指標,第五十一頁，共八十六頁。,(三)偶聯(lián)率及相對活力 偶聯(lián)率=(加入蛋白(d224。nb225。i)活力一上清液蛋白(d224。nb225。i)活力)/加入蛋白(d224。nb225。i)活力100% 活力回收=固定化酶總活力/加入酶的總活力100% 相對活力=固定化酶總活力/ (加入酶的總活力上清液中未偶聯(lián)酶活力)100%,第五十二頁，共八十六頁。,(四)半衰期 在連續(xù)測定條件下，固定化酶
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